寬杯杜鵑貯藏花粉特性及其與馬纓杜鵑雜交的應(yīng)用評價

韓 聰,楊秀梅,彭綠春,張 露,宋 杰,徐紅林,解瑋佳*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南 昆明 650201;2.國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心,云南 昆明 650205;3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所,云南 昆明 650205;4.云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650205;5.云南省花卉工程中心,云南 昆明 650205;6.云南省昆明市金殿名勝區(qū),云南 昆明 650224)

杜鵑屬(RhododendronL.)是世界著名的園林觀賞植物,云南八大名花之一。常綠杜鵑亞屬[RhododendronsubgenusHymenanthes(BI.) Koch]是杜鵑屬中的四大亞屬之一。中國西南部及毗鄰的東喜馬拉雅地區(qū)為常綠杜鵑亞屬的分布中心和分化中心[1]。近年來,一些從歐洲引進(jìn)的由常綠杜鵑亞屬種質(zhì)資源育成的杜鵑花即“高山杜鵑”成為了我國年宵花和高檔園林綠化的新秀[2-3]。高山杜鵑育種工作的滯后,導(dǎo)致我國高山杜鵑種質(zhì)利用率低下,產(chǎn)業(yè)發(fā)展受阻[4]。挖掘和引入本土種質(zhì)資源進(jìn)行育種開發(fā)對于高山杜鵑產(chǎn)業(yè)發(fā)展與提升具有重要意義。

筆者通過多年的資源調(diào)查評價后發(fā)現(xiàn),常綠杜鵑亞屬樹形杜鵑亞組[Subsect. Aroborea (Tagg) Sleumer]的馬纓杜鵑(RhododendrondelavayiFranch.)花色艷紅,觀賞性高,耐旱性強(qiáng),是育種的優(yōu)良親本材料[5];而瀕危杜鵑物種杯毛杜鵑亞組(Subsect. Falconera Sleumer)的寬杯杜鵑(RhododendronsinofalconeriBalf.f.)花黃色且葉大如榕葉,觀賞性好,資源有待開發(fā)[6-7]。以此為背景,筆者開展了以馬纓杜鵑為母本,以寬杯杜鵑為父本的雜交育種工作。然而,昆明地區(qū)的馬纓杜鵑在2月底～3月底開花,而原生地的寬杯杜鵑則在4月底～5月底開花,兩者雜交存在花期不遇的問題。筆者的研究結(jié)果表明,寬杯杜鵑的花粉在室溫保存1個月后花粉便失去活力。而現(xiàn)有的研究報道表明,超低溫(-80 ℃)冷藏能夠?qū)崿F(xiàn)杜鵑花粉的長期貯藏[8]。為了實(shí)現(xiàn)以上兩種野生種質(zhì)的雜交育種,本試驗(yàn)對寬杯杜鵑的花粉進(jìn)行超低溫貯藏,對其貯藏前后的花粉形態(tài)及活性進(jìn)行研究后,用貯藏花粉進(jìn)行雜交授粉,并對其雜交授粉后的花粉管萌發(fā)情況及受精情況進(jìn)行觀察,以期為今后開展亞組間花期不遇的杜鵑花雜交育種提供參考依據(jù),有效推進(jìn)我國的杜鵑花育種步伐,最終實(shí)現(xiàn)本土資源的商品化開發(fā)利用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)于云南省昆明市晉寧縣的云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所春禾試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)材料

以5～6年生、開花結(jié)果良好的馬纓杜鵑植株為母本植株；以寬杯杜鵑為父本材料,其花粉于2015年4月采自云南文山老君山薄竹峰(23°30′ N,103°94′ E,海拔2900 m)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 寬杯杜鵑花粉的收集 于2015年4月,從處于盛花期、花藥呈絮狀散出的寬杯杜鵑花朵中取新鮮花粉,放置于室內(nèi)干燥24～48 h,見花粉粒分離開來時,用毛筆蘸取花粉,在完成其花粉形態(tài)及活力測定后,將其轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,然后用封口膜將離心管口密封，將離心管保存于-80 ℃中待用。

1.3.2 寬杯杜鵑花粉貯藏前后的花粉形態(tài)觀察 采用掃描電鏡法對貯藏前(0 d)、-80 ℃貯藏310 d的寬杯杜鵑花粉形態(tài)進(jìn)行觀察。參照毛子軍等[9]的方法,用Erdtman醋酸酐分解法處理供試的寬杯杜鵑花粉。用雙面膠帶紙將處理后的花粉固定于樣品臺上,經(jīng)過噴金鍍膜后,在日立S-450掃描電鏡(SEM)下觀察、拍照并記錄。隨機(jī)選取約30?；ǚ?測量形態(tài)正?；ǚ鄣臉O軸長(P)、赤道軸長(E)，求得平均值,并計算其比值(P/E)。

1.3.3 寬杯杜鵑花粉貯藏前后的花粉活力測定 采用液體培養(yǎng)法測定寬杯杜鵑貯藏前(0 d)、-80 ℃貯藏310 d的花粉活力。試驗(yàn)采用的花粉液體萌發(fā)培養(yǎng)液配方為0.01% H3BO3+0.01% CaCl2+0.02% MgSO4·7H2O +0.01% KH2PO4+10%蔗糖。用毛筆蘸取離心管中的花粉,將它們均勻地灑落在盛有液體花粉萌發(fā)培養(yǎng)液的6 mL培養(yǎng)皿中,置25 ℃恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)6 h后取出,在Leica DM6000B熒光顯微鏡下觀察花粉的萌發(fā)情況并拍照,統(tǒng)計其萌發(fā)率；用Image-Pro Plus 6.0軟件處理測定其花粉管萌發(fā)長度。以花粉管長度超過花粉直徑為花粉萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。花粉萌發(fā)率(%)=萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉數(shù)×100%。每處理重復(fù)3次,每重復(fù)選取5個視野,每個視野花粉數(shù)不少于100粒。

1.3.4 寬杯杜鵑貯藏花粉與馬纓杜鵑雜交授粉 于2016年2～3月,以馬纓杜鵑為母本,-80 ℃貯藏310 d后的寬杯杜鵑花粉為父本材料,進(jìn)行人工雜交授粉,在雜交套袋后1周去除雜交袋。

1.3.5 雜交授粉后的花粉管生長及授精觀察 于2016年2～3月雜交授粉后,參照Williams等[10]的方法進(jìn)行花柱壓片。分別取馬纓杜鵑×寬杯杜鵑授粉后4、7、10、14、17、21 d的馬纓杜鵑雌蕊放入FAA固定液(甲醛∶冰醋酸∶70%乙醇=1∶1∶18)中固定24 h,隨后轉(zhuǎn)入70%的酒精中,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在壓片?將固定后的雌蕊用蒸餾水沖洗至無色,放入8 mol/L NaOH溶液中于60 ℃軟化6 h,再用蒸餾水沖洗至無色,然后用0.1%水溶性苯胺藍(lán)染色24 h。在解剖鏡下剝除子房壁后,將材料放置于載玻片中央,吸水并滴加1～2滴甘油,蓋上蓋玻片,在Leica DM6000B熒光顯微鏡下觀察雜交授粉后的寬杯杜鵑花粉管在馬纓杜鵑雌蕊中的生長情況及馬纓杜鵑胚珠的授精情況。每處理重復(fù)5次。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理,分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 寬杯杜鵑花粉貯藏前后的花粉形態(tài)及其活力變化

2.1.1 寬杯杜鵑貯藏前后的花粉形態(tài)變化 電鏡掃描結(jié)果顯示,貯藏前寬杯杜鵑花粉為復(fù)合型四合體花粉(圖1-1),呈正四面體排列,單?；ǚ蹫榻蛐?花粉表面有粘絲。極面觀是1粒在上、3粒在下或?yàn)?粒在上、1粒在下,呈圓角正三角形,具3孔溝,呈120°等距離排列,清晰可見溝內(nèi)萌發(fā)孔(圖1-2);赤道面觀為2粒在上、2粒在下(圖1-3);花粉外壁紋飾為不規(guī)則塊狀裂紋,表面由大小不一的瘤狀顆粒排列,具細(xì)網(wǎng)紋(圖1-4)。四合花粉的直徑為47.78～59.34 μm,平均56.56 μm;極軸長(P)為30.67～35.48 μm,平均33.24 μm;赤道軸長(E)為23.67～30.71 μm,平均27.39 μm;極軸/赤道軸(P/E)為1.16～1.29,平均1.21。

1：花粉群體(×700);2：花粉極面觀(×1500); 3：花粉赤道面觀(×1500);4：花粉外壁紋飾(×4000)。 圖1 貯藏前寬杯杜鵑的花粉形態(tài)

從圖2可以看出,經(jīng)過-80 ℃低溫貯藏310 d后的寬杯杜鵑花粉形態(tài)發(fā)生了很大變化,其四合體花粉膜出現(xiàn)不同程度的向內(nèi)凹陷、皺縮(圖2-1),單個花粉粒從原來的圓角正三角形變成了尖角正三角形(圖2-2、圖2-3)；將其花粉外壁放大來看(圖2-4),發(fā)現(xiàn)其花粉膜質(zhì)表面出現(xiàn)了明顯的龜裂現(xiàn)象。

2.1.2 寬杯杜鵑貯藏前后的花粉活力 從寬杯杜鵑的花粉離體萌發(fā)結(jié)果(表1)來看,其貯藏前的花粉活力為83.24%±5.72%,在-80 ℃低溫貯藏310 d后,其花粉活力下降至45.52%±4.12%。從花粉管萌發(fā)長度來看,貯藏后的花粉管萌發(fā)長度(0.13 mm±0.06 mm)顯著低于貯藏前的花粉管萌發(fā)長度(0.73 mm±0.13 mm)。

表1 寬杯杜鵑花粉貯藏前后的花粉活力及其所萌發(fā)的花粉管長度

2.2 寬杯杜鵑貯藏花粉(♂)與馬纓杜鵑(♀)雜交授粉后的花粉管生長及授精效果

從表2可以看出,寬杯杜鵑貯藏花粉在馬纓杜鵑柱頭表面的萌發(fā)率呈緩慢上升的趨勢,即從授粉后4 d的12.71%±13.93%逐漸上升至授粉后19 d的37.57%±17.68%,且授粉后4 d的花粉萌發(fā)率顯著地低于其余5個時間的,而在其余5個時間間花粉萌發(fā)率無顯著差異。從授粉后不同時間的花粉管生長及授精效果來看,寬杯杜鵑貯藏花粉的花粉管在授粉后7 d即可到達(dá)子房,進(jìn)入胚珠而完成授精作用。

表2 寬杯杜鵑貯藏花粉與馬纓杜鵑雜交授粉后的花粉管生長及受精情況

注：同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平。

從寬杯杜鵑貯藏花粉與馬纓杜鵑雜交授粉后花粉管生長的熒光顯微觀察結(jié)果(圖3)來看：在授粉后4 d,花粉在柱頭表面萌發(fā)(圖3-1),部分花粉管出現(xiàn)胼胝質(zhì)異常沉積現(xiàn)象(圖3-1),花粉管在花柱中的生長情況良好(圖3-4),但尚未到達(dá)子房(圖3-7);在授粉后10 d,柱頭表面的花粉管異常情況增多,花粉管出現(xiàn)增粗變大、胼胝質(zhì)塞等異常現(xiàn)象(圖3-2),在花柱內(nèi)的花粉管亦出現(xiàn)了增粗、胼胝質(zhì)塞等異?，F(xiàn)象(圖3-5),在此時期花粉管已進(jìn)入子房,胚珠內(nèi)亦出現(xiàn)胼胝質(zhì)異常沉積現(xiàn)象(圖3-8);在授粉后21 d,花粉管在柱頭表面(圖3-3)、花柱(圖3-6)、子房和胚珠(圖3-9)都有胼胝質(zhì)異常沉積現(xiàn)象。從觀察結(jié)果來看,寬杯杜鵑貯藏花粉與馬纓杜鵑雜交授粉后,其花粉管能正常生長,并完成授精作用。

1：花粉群體(×450);2：花粉極面觀(×1500); 3：花粉赤道面觀(×1500);4：花粉外壁紋飾(×2500)。 圖2 寬杯杜鵑在-80 ℃貯藏310 d后的花粉形態(tài)

3 討論與結(jié)論

花粉形態(tài)具有很強(qiáng)的遺傳保守性,其固有的輪廓、紋飾、萌發(fā)孔數(shù)目、位置等特征常用于植物分類鑒定。周蘭英等[11]研究認(rèn)為,杜鵑屬花粉外壁紋飾和萌發(fā)孔長度不宜作為亞屬劃分依據(jù),但四合體直徑可作為劃分亞屬的參考指標(biāo)。本研究中的寬杯杜鵑花粉四合體的直徑明顯大于周蘭英等[11]觀測的26種杜鵑花粉四合體的直徑，而且寬杯杜鵑的單粒花粉形狀及四合體直徑都與其研究的同亞組的大王杜鵑(R.rex)也有明顯差異。王玉國等[12]也有類似發(fā)現(xiàn),即同隸屬于云錦杜鵑亞組的廣福杜鵑(R.kwangfuense)與云錦杜鵑(R.fortunei)在花粉大小和萌發(fā)孔大小上有較大差異。因此,應(yīng)用花粉形態(tài)進(jìn)行杜鵑花植物分類鑒定時,應(yīng)當(dāng)慎重。

為解決杜鵑花雜交育種中的花期不遇問題而開展的花粉貯藏研究已有報道[8,13]。陸琳等對不同高山杜鵑花粉活力及花粉貯藏方法的研究結(jié)果顯示,低溫冷凍是高山杜鵑花粉的最佳貯藏條件,但具體的花粉貯藏條件因品種不同而有所差異,研究中的黃杯杜鵑花粉在-80 ℃貯藏120 d后的花粉萌發(fā)率仍達(dá)到45%。在本試驗(yàn)研究中,寬杯杜鵑花粉在-80 ℃貯藏310 d后其花粉活力雖較貯藏前有所下降,但仍具有較高的萌發(fā)率,可作為育種材料來應(yīng)用。本試驗(yàn)結(jié)果與陸琳等[8]的研究結(jié)果相似。而楊華等[13]對馬銀花(R.ovatum)花粉萌發(fā)和貯藏特性的研究結(jié)果認(rèn)為,在-80 ℃條件下貯藏花粉的萌發(fā)率隨貯藏時間的延長而下降,而在貯藏120 d時,-80 ℃貯藏的花粉活力較室溫(22～30 ℃)、3.3 ℃和-22 ℃貯藏的差,僅有14.64%。在低溫貯藏過程中,花粉細(xì)胞內(nèi)參與呼吸作用等生理過程的一些生物大分子物質(zhì)比如脂、糖、蛋白質(zhì)等以及酶活性均會發(fā)生一系列變化。耿興敏等[14]研究發(fā)現(xiàn),-80 ℃保存處理后的唐菖蒲花粉的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性增強(qiáng),從而減輕了低溫對花粉膜質(zhì)過氧化和膜系統(tǒng)的傷害程度。楊秀蓮等[15]對海州常山花粉低溫貯藏及其生理生化特性的研究也有類似的發(fā)現(xiàn),即海州常山花粉通過提高其自身的SOD、POD活性,以及增加其可溶性糖和可溶性蛋白含量來增強(qiáng)其抗寒性,維持自身活力,從而實(shí)現(xiàn)其在-80 ℃低溫下的長期貯藏。在本試驗(yàn)中，-80 ℃貯藏310 d的寬杯杜鵑花粉外壁出現(xiàn)了內(nèi)陷、皺縮等問題,這可能與其花粉膜質(zhì)過氧化造成的膜系統(tǒng)受害有關(guān)。

1：授粉后4 d,寬杯杜鵑花粉在馬纓杜鵑柱頭上萌發(fā),花粉管出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積現(xiàn)象(×20);2：授粉后10 d,寬杯杜鵑花粉管在馬纓杜鵑柱頭上出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積(×20);3：授粉后21 d,寬杯杜鵑花粉管在馬纓杜鵑柱頭上出現(xiàn)大量胼胝質(zhì)沉積(×20);4：授粉后4 d,寬杯杜鵑花粉管在馬纓杜鵑花柱中正常生長,少有胼胝質(zhì)沉積(×20);5：授粉后10 d,寬杯杜鵑花粉管在馬纓杜鵑花柱中出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積(×20);6：授粉后21 d,寬杯杜鵑花粉管在馬纓杜鵑花柱中出現(xiàn)大量的胼胝質(zhì)沉積;7：授粉后4 d,寬杯杜鵑花粉管未到達(dá)馬纓杜鵑子房,馬纓杜鵑子房和胚珠內(nèi)少有胼胝質(zhì)沉積(×20);8：授粉后10 d,寬杯杜鵑花粉管到達(dá)馬纓杜鵑子房并進(jìn)入胚珠,馬纓杜鵑胚珠內(nèi)出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積(×20);9：授粉后21 d,寬杯杜鵑大量花粉管達(dá)到子房并進(jìn)入胚珠,馬纓杜鵑胚珠內(nèi)胼胝質(zhì)沉積明顯增多(×20)；P:花粉粒; PT:花粉管;O:胚珠。

圖3寬杯杜鵑貯藏花粉與馬纓杜鵑雜交授粉后花粉萌發(fā)、花粉管生長及授精過程

杜克兵等[16]對不同貯藏條件下楊樹花粉活力的變化及隔年雜交授粉的應(yīng)用進(jìn)行可行性研究后認(rèn)為,-20 ℃保存1～2年后的楊樹花粉用于常規(guī)雜交育種是可行的,且方法簡單、經(jīng)濟(jì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，寬杯杜鵑貯藏花粉在馬纓杜鵑雌蕊上能夠正常萌發(fā),其花粉管在馬纓杜鵑花柱中亦能正常生長，表明利用貯藏花粉來解決寬杯杜鵑與馬纓杜鵑花期不遇問題,從而開展兩種杜鵑的常規(guī)雜交育種是切實(shí)可行的。

雜交育種是杜鵑花新品種培育的主要手段[17]。杜鵑花屬中不同亞屬、亞組間雜交通常很難或不可能實(shí)現(xiàn)[18-19],但也有成功的研究報道[20-22]。在本試驗(yàn)中,馬纓杜鵑與寬杯杜鵑雜交的花粉管在生長過程中出現(xiàn)膨大、變粗及胼胝質(zhì)沉積等異?，F(xiàn)象,這與Williams等[10]研究報道的杜鵑花種間雜交不親和障礙表現(xiàn)一致,證明兩種杜鵑雜交存在不親和現(xiàn)象。在整個雜交授粉試驗(yàn)中,寬杯杜鵑花粉與馬纓杜鵑雌蕊如何互作,馬纓杜鵑雌蕊發(fā)生了怎樣的生理變化,其基因如何表達(dá)等問題,還有待于今后的進(jìn)一步深入研究。

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