體細(xì)胞克隆猴的誕生及展望

廖兆蒂，劉 真，孫 強(qiáng)

(中國科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院，上海 200031)

作為第一個(gè)由體細(xì)胞克隆出的哺乳動(dòng)物，克隆羊Dolly的誕生為人們研究哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重編程開啟了一扇新的大門[1]。Dolly之后，科研工作者們便對(duì)體細(xì)胞重編程寄予了厚望并且相繼克隆出牛[2]、小鼠[3]、貓[4]等另外22種哺乳動(dòng)物[5]，然而克隆靈長類動(dòng)物截至2018年初依然是該領(lǐng)域的一個(gè)未解難題[6]。

1 靈長類克隆研究的發(fā)展歷程

其實(shí)早在1997年美國俄勒岡靈長類研究中心的Don Wolf實(shí)驗(yàn)室就已經(jīng)成功克隆出一雄一雌兩只恒河猴，但囿于當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)條件限制該研究僅采用6～16細(xì)胞時(shí)期早期胚胎細(xì)胞作為核供體細(xì)胞[7]。2002年，同樣來自Don Wolf實(shí)驗(yàn)室的Mitalipov以論文第一作者的身份在Biology of Reproduction發(fā)表了一篇利用恒河猴體細(xì)胞作為供體進(jìn)行核移植的研究[8]。該研究將30枚由卵裂球做為核供體獲得的胚胎(embryonic cell nuclear transfer, ECNT)和14枚體細(xì)胞做為核供體獲得的胚胎(somatic cell nuclear transfer, SCNT)分別移植入11只和3只受體，11只ECNT受體中只有一個(gè)懷孕并在155天時(shí)剖腹產(chǎn)獲得一個(gè)死胎，3只SCNT受體沒有一只懷孕。2003年，Schatten和同事將33枚克隆胚胎移植入16只受體但都沒有觀察到懷孕跡象，然而他們在116枚ECNT和30枚SCNT胚胎中觀察到幾乎所有這些核移植胚胎在有絲分裂時(shí)都發(fā)生了紡錘體紊亂和染色體錯(cuò)位等現(xiàn)象[9]。Schatten等認(rèn)為移除紡錘體導(dǎo)致了MII卵母細(xì)胞中核有絲分裂器(nuclear mitotic apparatus，NuMA)和驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(kinesin-related protein，HEST)的缺失或損傷，并進(jìn)而導(dǎo)致靈長類克隆胚胎不能正常有絲分裂。隨后，Paolo Martelli實(shí)驗(yàn)室在2004年發(fā)表的一篇研究中進(jìn)一步描述了該現(xiàn)象：重組胚胎中僅有14.8%能夠形成正常的紡錘體并進(jìn)行正常有絲分裂，其他大部分胚胎在微管組裝、染色體形成、紡錘體形成中都有或多或少的問題[10]。與之前Mitalipov和Schatten等的研究成果相似，Martelli及同事共將93枚體細(xì)胞重組克隆胚胎移植入31只受體中，雖然超聲檢查發(fā)現(xiàn)有7只懷孕，但孕期都沒有超過60 d。

多次的失敗和技術(shù)的更新促使該領(lǐng)域研究人員優(yōu)化體細(xì)胞克隆條件。核移植實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)的去核方法是在看不到紡錘體的情況下去核，即“盲吸法”。這種方法要求操作人員要首先在看不到核的情況下吸除第一極體及極體下10%左右的胞質(zhì)，然后用bisBenzimide(Hoechst 33342)將吸出的胞質(zhì)染色，最后在熒光顯微鏡下觀察被染色的胞質(zhì)中紡錘體是否被吸出。2004年，Martelli團(tuán)隊(duì)在研究胚胎重組后的第一次有絲分裂時(shí)首次使用Spindle View技術(shù)來去除卵母細(xì)胞的紡錘體，這是偏振光技術(shù)在靈長類克隆領(lǐng)域的首次嘗試[10]，而SpindleView也是后來OosightTM Imaging System的雛形[11]。2007年，Wolf等利用lamin A/C(一種核蛋白，可用來標(biāo)記細(xì)胞分化)來比較傳統(tǒng)核移植方法與OosightTM Imaging System所得到的克隆胚胎的差異[11]。對(duì)比表明利用偏振光去核不僅將去核成功率提高到100%，更重要的是將去核時(shí)間縮短到1 min之內(nèi)，避免了傳統(tǒng)染料染色、紫外照射等對(duì)胚胎造成的傷害。解決了傳統(tǒng)的“盲吸法”去核對(duì)卵母細(xì)胞造成損傷這一問題后，Mitalipov等進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞融合這一過程進(jìn)行了改造。Mitalipov等認(rèn)為傳統(tǒng)電刺激促使卵母細(xì)胞和體細(xì)胞融合的方法會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過早激活，所以在2010年發(fā)表的研究中使用仙臺(tái)病毒(Sendai virus, SeV)介導(dǎo)其融合[12]。另外，在重組胚胎激活的時(shí)間上也有了改進(jìn)，研究發(fā)現(xiàn)重組胚胎融合后立即激活的囊胚率(20%)比融合2 h后再激活的囊胚率(12%)更高[12]。通過這些技術(shù)和方法上的改進(jìn)，Mitalipov等將恒河猴體細(xì)胞克隆囊胚發(fā)育率提升了3倍，核移植囊胚用于干細(xì)胞建系的成功率(29%)也比之前大大提升，為之后人的克隆胚胎建系提供了重要的參考價(jià)值。另一方面，盡管技術(shù)上的改進(jìn)提高了囊胚發(fā)育率，在該工作中移植的67枚胚胎中只有一枚發(fā)育成胎兒并檢測到心跳，且在妊娠第81天流產(chǎn)[12]。

由于哺乳動(dòng)物克隆胚胎普遍存在發(fā)育率和存活率極低的現(xiàn)象，研究人員開始研究體細(xì)胞重編程的機(jī)制并試圖尋找一些能夠提高哺乳動(dòng)物克隆效率的因子。2005年，Wakayama團(tuán)隊(duì)首次使用一種組蛋白去乙?；种埔蜃忧乓志谹(histone deactylase inhibitor A, TSA)來處理重組胚胎從而將重組胚胎的囊胚率提高了2～5倍，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)過TSA處理的克隆胚胎干細(xì)胞建系效率比未處理的胚胎提高了至少3倍[13]。2007年，這一團(tuán)隊(duì)利用TSA處理后的ICR克隆胚胎克隆出第一個(gè)封閉群小鼠[14]。2009年，Wakayama團(tuán)隊(duì)使用另一種組蛋白去乙?；种埔蜃覵CR(scriptaid)替代TSA并首次克隆出近交系小鼠[15]。此后多項(xiàng)研究也都證實(shí)了TSA和SCR可明顯提高克隆胚胎的囊胚率[16-17]。Mitalipov在2010年發(fā)表的研究中也使用了TSA來處理靈長類克隆重組胚胎，研究表明TSA處理后的實(shí)驗(yàn)組囊胚率可達(dá)到18%，明顯高于對(duì)照組5%的囊胚率[12]。盡管該實(shí)驗(yàn)對(duì)胚胎操作和培養(yǎng)都有優(yōu)化，但依然沒有個(gè)體存活[12]。

哺乳動(dòng)物克隆的另一重大意義是使體細(xì)胞經(jīng)過重編程后從高度分化狀態(tài)還原到未分化狀態(tài)，因此克隆胚胎用來建立干細(xì)胞系就變得尤為重要。Mitalipov等在2007年采用成年雄性恒河猴的皮膚細(xì)胞進(jìn)行核移植，首次建立了兩支克隆猴胚胎干細(xì)胞系(cloned rhesus embryonic stem)，CRES-1和CRES-2[18]，兩支雌性干細(xì)胞系(CRES-3和CRES-4)也在2009年通過同樣的方法建立[19]。隨后Mitalipov等對(duì)這些克隆干細(xì)胞系進(jìn)行了表觀研究并發(fā)現(xiàn)，CRES中H3K9me3要比其在體細(xì)胞中的甲基化程度低很多，而二者H3K27me3、H3K4me3的表達(dá)水平則相似，并且CRES中H3K9me3、H3K27me3和H3K4me3的表達(dá)量與正常體外受精的囊胚建立的干細(xì)胞系(ORMES)相似[19]。2014年哈佛大學(xué)張毅實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)小鼠胚胎二細(xì)胞時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組比較分析發(fā)現(xiàn)，核移植胚胎中存在一些重編程抗性區(qū)域(reprogramming resistant regions, RRRs)，而這些RRRs區(qū)基因在體外受精的二細(xì)胞胚胎中正常表達(dá)[20]。更有趣的是，由于體細(xì)胞中這些RRRs區(qū)基因多富集H3K9me3，在胚胎中外源表達(dá)Kdm4d(一種H3K9me3去甲基化酶)不僅可以將這些基因重新激活，還可大幅度提高小鼠體細(xì)胞克隆的效率。利用H3K9甲基化酶基因Suv39h1/2敲除的體細(xì)胞作為核供體也可提高克隆效率。因此該研究認(rèn)為H3K9me3是影響核移植介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重編程過程中一個(gè)至關(guān)重要的表觀因素[20]。在此之前，2012年來自新西蘭的G?tz Laible實(shí)驗(yàn)室就用Kdm4d同一家族的Jmjd2b(也叫Kdm4b)基因打靶干細(xì)胞，并利用陽性細(xì)胞作為供體進(jìn)行小鼠核移植實(shí)驗(yàn)[21]，但可惜的是干細(xì)胞注入胚胎后不久其H3K9me3的表達(dá)就恢復(fù)成正常細(xì)胞的水平。所以最終該研究表示雖然對(duì)干細(xì)胞的基因操作改善了小鼠核移植胚胎的囊胚發(fā)育率，但實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎著床比例并沒有顯著差別。

克隆猴“中中”和“華華”(見圖1)之所以能夠誕生正是綜合了這些改善后的條件并在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化。首先利用偏正光核示蹤技術(shù)快速高效地將MII卵母細(xì)胞的核去掉；然后將Hemagglutinin Virus of Japan (HVJ-E)病毒處理過的細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞并介導(dǎo)融合；重組胚胎融合后1 h左右將其激活，激活也相比之前的ionomycin和6-dime-thylaminopurine (I/D)多了TSA，即I/D/T；在激活并培養(yǎng)一段時(shí)間后，科研人員將Kdm4d mRNA注入這些激活后的胚胎并獲得相較對(duì)照組來說較多的優(yōu)質(zhì)囊胚(11/17, 64.7%)；另外，優(yōu)秀的獸醫(yī)團(tuán)隊(duì)在前期取卵，后期胚胎移植、B超檢查、孕猴照料和克隆猴生產(chǎn)等工作中的作用也是無可替代的。

圖1 150天的克隆猴“中中”(后)和“華華”(前)Fig 1 150 days of cloned monkey "Zhong Zhong" and "Hua Hua"

2 克隆猴誕生的意義與面臨的困難

此次體細(xì)胞克隆猴的誕生不僅將我們對(duì)克隆靈長類動(dòng)物可行性的認(rèn)知提升到一個(gè)新的臺(tái)階，對(duì)于人類疾病的相關(guān)研究也起到不可替代的作用。目前大多數(shù)對(duì)于人類疾病(特別是腦疾病)的相關(guān)研究仍處于小鼠水平，但小鼠和人之間的物種差異導(dǎo)致在小鼠水平上做出的研究成果很大程度上不能平行遷移到人體水平，這預(yù)示著我們?nèi)孕璺侨遂`長類(如猴子)來回答小鼠和人都不能回答的問題；另外，許多近交系小鼠如DBA、C57BL、BALB/c、129等由于其廣泛的實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，早已是科研工作中的重要模式生物，然而這些近交系的建立是通過20代以上的不斷自交獲得的，這對(duì)生長發(fā)育緩慢、繁殖周期長的靈長類動(dòng)物來說顯然是不現(xiàn)實(shí)的。體細(xì)胞克隆技術(shù)可以幫助我們得到一群基因背景近乎一致的猴子，極大地克服了靈長類動(dòng)物之間個(gè)體差異大、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差等缺陷；還可對(duì)體細(xì)胞定向基因打靶，通過一系列篩選步驟篩選出陽性克隆后將其用作核移植的供體細(xì)胞，從而克隆出特定的疾病模型猴并進(jìn)一步開展相關(guān)疾病的研究；通過這種方法獲得的基因編輯猴在F0代不會(huì)出現(xiàn)嵌合體；最后，由于疾病模型猴的基因背景一致，可大大減少生物醫(yī)療領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的使用量，幫助篩選人類疾病的有效藥物，縮減新藥研發(fā)、臨床實(shí)驗(yàn)等的周期和費(fèi)用。

盡管如此，靈長類克隆研究領(lǐng)域依然還有很多問題需要回答：1)這項(xiàng)研究所用的體細(xì)胞是流產(chǎn)的胎猴成纖維細(xì)胞，成年猴子成纖維細(xì)胞或其他類型細(xì)胞作為供體的可行性依然面臨挑戰(zhàn)； 2)仍沒有利用該方法出生的特定疾病猴模型或者工具猴模型；3)Kdm4d主要作用于早期胚胎發(fā)育，提高囊胚發(fā)育率，但對(duì)胚胎著床后的發(fā)育影響仍未可知。

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