紫色土植物促生菌篩選及其復(fù)合菌劑對生姜種苗的促生效應(yīng)

申 鴻吳 波李洪海劉奕清吳興文楊星勇

（1西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；2農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所，四川成都 610041；3重慶文理學(xué)院特色植物產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 402160；4重慶天沛生姜研究院有限公司，重慶市生姜資源利用工程技術(shù)研究中心，重慶 402160；5重慶市梁平區(qū)經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站，重慶 405200；6重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是藥食兩用蔬菜和保健功能食品，有數(shù)千年的栽培歷史，也是國家“十三五”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)特色蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系重要蔬菜之一。生姜多采用無性繁殖留種，導(dǎo)致姜種感染病原菌，極易引發(fā)姜瘟病等。無菌組培種姜（苗）是降低姜瘟病發(fā)生的有效途徑之一，如何提高生姜無菌組培種苗馴化移栽的成活率和種苗質(zhì)量，則是生姜組培種苗規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵（劉奕清等，2010a）。

植物促生菌（plant growth promoting bacteria，PGPB）能夠提高植株對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，抑制病原微生物的繁殖。近年來植物促生菌在水稻、小麥、玉米、大豆等大田作物（吳皓瓊 等，2011；鄧振山 等，2012；高君君 等，2012），以及馬鈴薯、番茄、辣椒、甘藍(lán)、黃瓜、櫻桃、冬棗和獼猴桃等果蔬上已有大量應(yīng)用研究（林啟美 等，2002；Han & Lee，2006；呂德國 等，2008；劉方春 等，2012，2013；Islam et al.，2013；田婧 等，2016；Shen et al.，2016），但有關(guān) PGPB 在促進生姜組培種苗生長效應(yīng)等方面的研究鮮見報道。

本試驗在前期生姜組培種苗移栽基質(zhì)篩選及肥水調(diào)控研究基礎(chǔ)上（劉奕清 等，2010b），通過篩選出具競爭優(yōu)勢的紫色土土著PGPB，進而制成復(fù)合菌劑，并開展不同菌劑對生姜種苗生長效應(yīng)的研究，以期為生姜種苗規(guī)?；N植應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤PGPB的分離、純化和菌種鑒定

2013年9月從西南大學(xué)國家紫色土肥力與肥料效應(yīng)監(jiān)測基地（30°26′N，106°26′E）的長期輪作蔬菜〔普通白菜（小白菜）—萵苣—辣椒—大豆〕土壤中，選擇3塊1 m×1 m范圍土壤，按5點采樣法收集10～20 cm土層土壤，混合均勻后分裝，于4 ℃保存供菌種分離。

PGPB的分離、純化采用稀釋平板法，其中自生固氮菌、溶磷菌和解鉀菌的篩選分別采用阿須貝無氮培養(yǎng)基、PKO無機磷培養(yǎng)基和解鉀菌選擇培養(yǎng)基（Shen et al.，2016）。挑取生長速度快或周圍有透明圈的菌株，使用劃線法于選擇培養(yǎng)基分離純化，直至純培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至LB斜面培養(yǎng)，-80 ℃保存菌種。

采用凱氏定氮法測定固氮菌固氮能力（Akhter et al.，2012），采用鉬銻抗比色法測定溶磷菌溶磷能力（Perez et al.，2007），采用火焰分光光度計法測定解鉀菌解鉀能力（易浪波 等，2012）。菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001），以通用引物27F、1492R擴增各菌株16S rDNA，PCR擴增產(chǎn)物（1 300～1 500 bp）送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序。所得結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，最后使用MEGA 6.06軟件的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行分子生物學(xué)鑒定。

1.2 復(fù)合菌劑對生姜種苗的盆栽試驗

1.2.1 試驗材料 試驗于2015年4月在西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院盆栽場進行。選擇株高4～5 cm、根系完整、葉色正常、生長健壯的生姜組培種苗為供試植物（由重慶市特色植物種苗工程技術(shù)研究中心組培實驗室提供）；以紫色土為供試土壤，基本理化性質(zhì)：pH=5.5，有機質(zhì)含量 8.44 g· kg-1，全氮 0.92 g · kg-1，全磷 0.54 g · kg-1，全鉀 16.7 g · kg-1，堿解氮 43.2 mg · kg-1，有效磷 11.0 mg · kg-1，速效鉀65.3 mg · kg-1；以生產(chǎn)中普遍應(yīng)用的牛糞做底肥（采自重慶市北碚區(qū)良種牛繁育中心），基本理化性質(zhì)：含水量58.9%，全碳40.12%，全氮1.34%，全磷13.11 g · kg-1，全鉀8.11 g· kg-1，碳氮比32.11。

1.2.2 試驗設(shè)計 設(shè)無牛糞-單施復(fù)合菌劑處理（T1）、牛糞-拌施復(fù)合菌劑處理（T2），以牛糞底肥育苗（CK1）和牛糞-拌施市售生物菌肥（CK2）為對照，共4個處理。其中T1為PGPB菌懸液與供試土壤混合成接種劑；T2為PGPB菌懸液與牛糞混合成接種劑，PGPB菌懸液為3菌株按1∶1∶1菌數(shù)比例混合，裝盆前與牛糞/土壤混合成接種劑（每克牛糞/土約含3×105cfu）；CK2為市售生物菌肥寶祿1號（POLUMA-1，重慶寶祿滿農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司），裝盆前與牛糞混合成接種劑（每克牛糞約含 1×108cfu）。

選用2 L塑料花盆，每盆裝土1.5 kg，按接種量5%計，每盆混施入各處理接種劑（或牛糞）80 g。3 d后移栽生姜組培苗，每盆2株，每處理4次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。每天定量澆水，使土壤持水量為15%～20%。試驗周期為90 d。

1.2.3 植株農(nóng)藝性狀測定 試驗結(jié)束時分別測定姜苗株高、葉片數(shù)、最大葉片葉面積、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀和地上部、地下部鮮質(zhì)量，于105 ℃殺青10 min后，80 ℃烘干至恒重，測定植株地上部、地下部干質(zhì)量。

1.2.4 土壤理化性質(zhì)測定和微生物數(shù)量分析 試驗結(jié)束時，采用抖根法收集根際土，4 ℃保存，其中10 g用于微生物數(shù)量測定，余土風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)分析。采用稀釋平板計數(shù)法測定土壤中自生固氮菌、溶磷菌、解鉀菌等細(xì)菌數(shù)目（中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室，1985）；分別采用酸度計法、鉻酸鉀容量法、凱氏定氮法、鉬藍(lán)比色法、火焰光度法、堿解擴散法、Olsen法、NH4Ac-火焰光度法測定土壤pH值、有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀含量（楊劍虹 等，2008）。

1.2.5 種苗生理生化指標(biāo)測定 采用H2SO4-H2O2消煮開氏定氮法、釩鉬黃比色法、火焰光度法測定植株氮、磷、鉀含量（楊劍虹 等，2008）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Microsoft Excel 2007軟件制作圖表，使用SPSS 18.0軟件進行AVONA單因素方差統(tǒng)計分析以及Duncan多重比較分析（P≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤PGPB形態(tài)及生理生化特征

通過選擇培養(yǎng)基的篩選，共分離獲得6株自生固氮（GN）菌、6株溶磷（RP）菌和5株解鉀（JK）菌。本試驗選取自生固氮菌GN03、溶磷菌RP01和解鉀菌JK02，作為PGPB候選菌株開展研究。

從圖1-A、B和表1可以看出，自生固氮菌GN03在阿須貝無氮培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為白色半透明狀，光滑濕潤，圓形微隆起，邊緣整齊。革蘭氏陽性菌，芽孢呈橢圓形、中生，莢膜肥厚。培養(yǎng)1～2 d，菌落直徑2～3 mm；培養(yǎng)3～5 d，菌落直徑6～8 mm。

從圖1-C、D和表1可以看出，溶磷菌RP01在溶磷菌選擇培養(yǎng)基上能形成明顯的溶磷圈，菌落形態(tài)濕潤透明，難以挑起，邊緣整齊。革蘭氏陽性菌，芽孢呈橢圓形、中生，莢膜肥厚。培養(yǎng)1～2 d，菌落直徑2～3 mm；培養(yǎng)3～5 d，菌落直徑5～6 mm。

圖1 菌株染色結(jié)果及菌落形態(tài)

表1 PGPB生理生化特征鑒定

從圖1-E、F和表1可以看出，解鉀菌JK02在解鉀菌選擇培養(yǎng)基上形成解鉀圈，菌落形態(tài)為濕潤凸起，呈乳白色，邊緣整齊。革蘭氏陽性菌，芽孢呈橢圓形、中生或次端生，莢膜肥厚。培養(yǎng)1～2 d，菌落直徑1～2 mm；培養(yǎng)3～5 d，菌落直徑5～7 mm。

2.2 土壤PGPB的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析與鑒定

對 GN03、RP01、JK02菌 株 進 行 基 于 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明：GN03與多株解淀粉芽孢桿菌屬菌株相似度達(dá)到99%以上，RP01與多株短小芽孢桿菌屬菌株相似度達(dá)到99%以上，JK02與多株芽孢桿菌屬菌株相似度達(dá)到98%以上（圖2）。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA鑒定結(jié)果，試驗篩選的自生固氮菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens spp.），將其命名為B. amyloliquefaciens GN03；溶磷菌鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus spp.），將其命名為B.pumilus RP01；解鉀菌鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans spp.），將其命名為B. circulans JK02。這3個菌株的16S rDNA序列已提交GenBank，登錄號分別為KU922934、KU922935和 KU922936。

圖2 GN03、RP01、JK02菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 接種復(fù)合菌劑處理對生姜種苗根際土壤微生物數(shù)量的影響

盆栽試驗結(jié)果表明（表2），各處理生姜種苗根際土壤微生物數(shù)量存在顯著差異，土壤細(xì)菌總數(shù)排序為：T1＞T2＞CK2＞CK1。其中，單施牛糞（CK1）和牛糞-拌施市售生物菌肥（CK2）2個處理的土壤細(xì)菌總數(shù)僅為（1～20）×106cfu·g-1，均處于較低水平。而接種PGPB復(fù)合菌劑的2個處理（T1和T2）的根際微生物數(shù)量顯著提升：與CK2相比，T2處理的根際細(xì)菌總數(shù)、固氮菌、溶磷菌和解鉀菌數(shù)量分別提高了212.2%、1 674.1%、8 709.1%和225.2%。

2.4 接種復(fù)合菌劑處理對生姜種苗根際土壤氮、磷、鉀含量的影響

與單施牛糞（CK1）和單施復(fù)合菌劑（T1）處理相比，牛糞-拌施市售生物菌肥處理（CK2）和牛糞-拌施復(fù)合菌劑處理（T2）提高了生姜種苗根際土壤中全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷含量（表3）。其中T2處理的土壤速效磷、速效鉀含量分別較CK2顯著提高了87.5%和23.0%。

2.5 接種復(fù)合菌劑處理對生姜種苗生長的影響

從表4可以看出，各處理生姜種苗的株高、葉片數(shù)、葉面積、地下部和地上部干質(zhì)量等指標(biāo)差異明顯，姜苗總體生長勢表現(xiàn)為：T2＞T1＞CK2＞CK1（圖3）。牛糞-拌施復(fù)合菌劑處理（T2）能顯著改善生姜植株種苗的生長，姜苗分蘗數(shù)、葉面積和地上部、地下部干質(zhì)量，分別較CK2提高了40.0%、45.9%和28.6%、25.0%。單施復(fù)合菌劑處理（T1）的植株生長狀況雖略優(yōu)于CK1，但其姜苗分蘗數(shù)最少。

表2 不同復(fù)合菌劑處理對生姜種苗根際微生物數(shù)量的影響

表3 不同復(fù)合菌劑處理對姜苗根際土壤有機質(zhì)、氮、磷、鉀含量的影響

表4 不同復(fù)合菌劑處理對生姜種苗農(nóng)藝性狀的影響

圖3 植物促生菌對生姜幼苗農(nóng)藝性狀的影響（盆栽90 d）

表5 不同復(fù)合菌劑處理對姜苗氮、磷、鉀含量的影響 mg·kg-1

2.6 接種復(fù)合菌劑處理對生姜種苗氮、磷、鉀含量的影響

從表5可以看出，與生姜植株生長狀況一致，牛糞-拌施復(fù)合菌劑處理（T2）的植株地下部和地上部N、P、K含量均高于其他處理，其中姜苗地上部鉀、地下部氮、磷含量較CK2分別提高了22.2%、30.0%和16.7%。

3 結(jié)論與討論

設(shè)施菜田土壤極易出現(xiàn)微生物多樣性下降、病原菌增多和寄生線蟲為害等土壤微生物學(xué)障礙問題（田永強 等，2013）。與土著微生物種群相比，微生物肥料中的外源性PGPB可能沒有競爭優(yōu)勢，導(dǎo)致其定殖能力低下、遺傳性狀不穩(wěn)定（杜曉燕 等，2008），因此微生物肥料的有效性問題長期處于研究熱點。

本試驗分別篩選、鑒定獲得紫色土土著PGPB自生固氮菌（Bacillus amyloliquefaciens GN03）、溶磷菌（Bacillus pumilus RP01）和解鉀菌（Bacillus circulans JK02）。將這3個菌株按1∶1∶1菌數(shù)與牛糞基質(zhì)混合制成復(fù)合菌劑，研究復(fù)合菌劑對生姜種苗的促生效應(yīng)。盆栽試驗結(jié)果表明，與接種牛糞-拌施市售生物菌肥相比，牛糞-拌施復(fù)合菌劑處理的根際細(xì)菌總數(shù)、固氮菌、溶磷菌和解鉀菌數(shù)量分別提高了212.2%、1 674.1%、8 709.1%和225.2%，表明試驗篩選的GN03、RP01和JK02不僅具紫色土生態(tài)適應(yīng)能力，更較普通市售微生物肥料具有強烈的土著微生態(tài)環(huán)境競爭優(yōu)勢，因此能顯著促進植物根際促生菌的增殖。這與劉方春等（2013）接種PGPR對冬棗根際土壤微生態(tài)環(huán)境的研究結(jié)果一致。此外，土壤速效磷、速效鉀含量分別顯著提高了87.5%和23.0%，表明篩選并使用適宜的土著根際促生菌能促進難溶態(tài)磷素等養(yǎng)分的供應(yīng)，改善土壤養(yǎng)分狀況，這與冬棗（劉方春 等，2013）、獼猴桃（Shen et al. 2016）等根際土壤微環(huán)境特征的研究結(jié)果一致。本試驗中，姜苗地上部鉀、地下部氮、磷養(yǎng)分含量分別提高了22.2%、30.0%和16.7%，與辣椒（Han & Lee，2006）、黃瓜（Han &Lee，2006）、甜菜（Shi et al.，2011）以及獼猴桃（Shen et al.，2016）上的研究結(jié)果一致，表明接種適宜的PGPB能提高姜苗養(yǎng)分含量，顯著改善種苗對養(yǎng)分的吸收利用。與接種牛糞-拌施市售生物菌肥相比，接種牛糞-拌施復(fù)合菌劑的生姜種苗的分蘗數(shù)、葉面積和地上部、地下部干質(zhì)量分別提高了40.0%、45.9%和28.6%、25.0%，表明接種土著植物促生菌不僅能顯著改善生姜種苗的生長，還能夠促進生姜種苗分蘗，與前人在玉米（Zahid et al.，2015）、甘藍(lán)（Piromyou et al.，2013）上的研究結(jié)果一致。

生姜種苗地下莖質(zhì)量和分蘗數(shù)等生物學(xué)性狀，直接影響種苗的經(jīng)濟價值，因此，選擇適宜的植物促生菌，并結(jié)合適宜的有機質(zhì)配方制成PGPB復(fù)合微生物菌肥，對于生姜種苗的生產(chǎn)具有重要作用。在后續(xù)研究中，還需進一步開展植物促生復(fù)合微生物菌肥的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，如各菌株的商業(yè)性擴繁體系建立、商業(yè)化菌肥中各菌株投放比例、菌肥基質(zhì)的優(yōu)化、菌肥質(zhì)量控制體系的建立等，以期實現(xiàn)生姜種苗擴繁制種的規(guī)?；瘧?yīng)用，為姜農(nóng)提供優(yōu)質(zhì)姜種。

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