北京地區(qū)南瓜病毒病病原種類鑒定

陳利達(dá) 曹金強(qiáng) 石延霞 柴阿麗 謝學(xué)文李寶聚

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

南瓜（Cucurbita moschata Duch.，中國(guó)南瓜）、筍瓜（Cucurbita maxima Duch. ex Lam.，印度南瓜）、西葫蘆（Cucurbita pepo L.，美洲南瓜）、墨西哥南瓜（Cucurbita mixta Pangalo）和黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia Bouché）并列為世界上南瓜屬作物的5個(gè)栽培種（李昕升 等，2017）。南瓜因產(chǎn)量高、效益好，且具有一定的保健作用，成為我國(guó)北方地區(qū)菜糧兼用作物之一。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2014年全世界南瓜產(chǎn)量約為2 519萬t，我國(guó)占世界當(dāng)年總產(chǎn)量的28.74 %，居世界第1位（王璐，2017）。隨著南瓜種植規(guī)模的擴(kuò)大，病毒病也愈發(fā)嚴(yán)重，成為制約南瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一，尤其在高溫干旱的年份，嚴(yán)重影響南瓜的品質(zhì)與產(chǎn)量。據(jù)報(bào)道，能夠侵染南瓜的病毒種類有80多種，其中小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、 南 瓜 花 葉 病 毒（Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）和馬鈴薯Y病毒（Potato viurs Y，PVY）（Lecoq et al.，1997；Fletcher et al.，2000；周賢，2013；劉嘉峪 等，2017）發(fā)生相對(duì)普遍。

近年來北京地區(qū)南瓜的種植面積逐年增加，南瓜病毒病危害日趨嚴(yán)重，本文針對(duì)北京周邊地區(qū)采集的疑似感染病毒病的南瓜葉片，采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，以期了解北京地區(qū)南瓜上主要病毒種類及其分布，為當(dāng)?shù)啬瞎喜《静〉姆揽睾涂共∑贩N的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016～2017年，在北京周邊地區(qū)采集疑似感染病毒病的南瓜樣本（葉片）共84份：順義區(qū)32份、昌平區(qū)15份、大興區(qū)12份、海淀區(qū)25份。所采樣品均保存在-80 ℃冰箱備用。

1.2 試劑與儀器

試劑：TRIzol Reagent購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司；2×Taq Mix（MT201）購(gòu)自博邁德科技（北京）有限公司。

儀器設(shè)備：3K15型高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；移液槍，德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；Jel Doc 2001型凝膠成像系統(tǒng)、Bio-Rad S1000 PCR儀，美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)。

1.3 植物總RNA提取

采用TRIzol法提取南瓜葉片總RNA。取100 mg南瓜葉片于液氮中研磨，將0.2 g粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，迅速加入1 mL TRIzol試劑，振蕩混勻，室溫下靜置5 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入0.2 mL氯仿混勻，室溫放置5 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；取水相（約400 μL）加入等體積的異丙醇，室溫下靜置10 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀2次，4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min；自然干燥，加入50 μL RNase-Free ddH2O溶解；以健康南瓜葉片總RNA為陰性對(duì)照，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 南瓜病毒病樣本RT-PCR檢測(cè)

以提取總RNA為模板，用FastQuant RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成病毒的cDNA第一條鏈。使用已報(bào)道的 CMV-F/CMV-R、SqMV-1/SqMV-2、PRSV-F/PRSV-R和PVY-1/PVY-2特異性引物（表1）對(duì)不同樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其中ZYMV-1/2和WMV-1/2是根據(jù)GenBank已有的病毒外殼蛋白基因（Coat Protein，CP）序列所設(shè)計(jì)。所用引物均由博邁德科技（北京）有限公司合成。

表1 用于南瓜病毒病分子檢測(cè)的引物信息

PCR擴(kuò) 增 體 系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物送至博邁德科技（北京）有限公司進(jìn)行測(cè)序，并利用NCBI序列比對(duì)工具BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序，根據(jù)核酸序列同源性確定病毒種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)采集的84份南瓜病毒病樣本（葉片）提取總RNA，利用不同特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，部分檢測(cè)結(jié)果見圖1。待測(cè)樣品中引物CMV-F/CMV-R可擴(kuò)增出大小735 bp的條帶（圖1-a），引物ZYMV-1/ZYMV-2可擴(kuò)增出大小582 bp的條帶（圖1-b），引物WMV-1/WMV-2可擴(kuò)增出大小697 bp的條帶（圖1-c），陰性對(duì)照均未擴(kuò)增出目的條帶。表明在待檢樣品中能分別測(cè)出CMV、ZYMV和WMV，但未檢測(cè)到SqMV、PRSV、PVY。

圖1 南瓜部分樣品RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 南瓜主要病毒種類檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采集的84份南瓜病毒病樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中79份病樣檢測(cè)顯示陽性，檢出3種病毒分別為CMV、ZYMV和WMV，病毒檢出率94.05%。其中CMV檢出率最高，可達(dá)52.38%；其次為ZYMV，檢出率44.01%；WMV檢出率14.29%（表2）。因此，CMV在北京地區(qū)南瓜上侵染最普遍，為優(yōu)勢(shì)病毒種類。

北京不同地區(qū)南瓜病毒種類及發(fā)生程度有所差異（表2）。在南瓜植株上檢出的病毒種類最多的是順義區(qū)和海淀區(qū)，檢測(cè)到3種病毒，這2個(gè)地區(qū)南瓜病毒病發(fā)生最為嚴(yán)重；其次是昌平區(qū)和大興區(qū)，分別檢測(cè)出2種病毒，該地區(qū)病毒病危害較輕。

表2 北京地區(qū)南瓜病毒種類及分布

2.3 南瓜植株上病毒的復(fù)合侵染情況

北京地區(qū)84份南瓜病毒病樣品中，發(fā)現(xiàn)14份病樣為2種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率為16.67%（表3）。其中，北京順義區(qū)南瓜病毒病復(fù)合侵染種類為CMV和ZYMV，侵染率為18.75%；海淀區(qū)南瓜病毒病復(fù)合侵染種類為ZYMV和WMV，侵染率為32.00%，未檢出3種病毒復(fù)合侵染。

表3 北京地區(qū)南瓜病毒復(fù)合侵染類型及分布

2.4 北京地區(qū)南瓜病毒病田間癥狀

圖2 南瓜病毒病田間發(fā)病癥狀

南瓜病毒病的發(fā)生可貫穿植株整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期，為系統(tǒng)性侵染。北京地區(qū)南瓜病毒病主要包括花葉、褪綠和皺縮等癥狀，經(jīng)室內(nèi)分子檢測(cè)后得知田間病毒種類為CMV、ZYMV和WMV 3種。CMV田間癥狀（圖2-a）：葉片葉綠素分布不均，易出現(xiàn)黃色或淡黃色病斑。嚴(yán)重時(shí)葉片變小變脆，出現(xiàn)淺黃色部分斑駁，呈現(xiàn)黃綠分布不均的鑲嵌狀花葉癥狀。ZYMV田間癥狀（圖2-b）：葉面出現(xiàn)花葉及斑駁癥狀，部分葉肉逐漸褪綠黃化，易出現(xiàn)明脈。嚴(yán)重時(shí)植株矮化，節(jié)間變短，葉緣卷曲形成雞爪狀，并常伴有蕨葉及葉面凹凸起伏癥狀。WMV田間癥狀（圖2-c）：葉片變小變硬，葉緣部分失綠并伴有斑駁等癥狀。發(fā)病中后期植株表現(xiàn)皺縮矮化、葉片卷曲，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)莖蔓變短，發(fā)病組織呈瘤狀突起。混合侵染的植株發(fā)病癥狀表現(xiàn)較為復(fù)雜，發(fā)病較重。CMV和ZYMV復(fù)合侵染后植株矮化，葉緣卷曲，葉片顏色變淺，出現(xiàn)蕨葉及葉面不平現(xiàn)象（圖2-d）。ZYMV和WMV復(fù)合侵染現(xiàn)象廣泛存在，其癥狀在葉片上表現(xiàn)明顯，葉片出現(xiàn)褪綠黃化，易形成深淺綠色相間花葉，伴有皺褶卷曲現(xiàn)象。有時(shí)葉緣處有斑駁突起，病株生長(zhǎng)遲緩，開花結(jié)果后病情趨于加重（圖2-e）。

3 結(jié)論與討論

病毒病是制約南瓜生產(chǎn)的重要因素之一，隨著我國(guó)南瓜種植面積逐年增加，病毒病的危害日益加重，給南瓜生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。南瓜病毒病在我國(guó)長(zhǎng)江地區(qū)、內(nèi)蒙古、新疆、黑龍江等地普遍發(fā)生（馬英，2017）。不同地區(qū)引起南瓜病毒病的毒源種類不盡相同，新疆石河子地區(qū)南瓜病毒病毒源種類主要為CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W（任琛榮 等，2016）；黑龍江地區(qū)南瓜病毒病的毒源種類為CMV和WMV（楊國(guó)慧，2003）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，侵染北京地區(qū)南瓜的主要毒源有CMV、ZYMV和WMV 3種，未檢測(cè)到SqMV、PRSV、PVY等其他病毒，由于病毒分布具有區(qū)域性，目前SqMV只在黑龍江南瓜上有相關(guān)報(bào)道（李鳳梅，2002）。其他病毒種類也未檢出，可能是由于采樣數(shù)量少或部分南瓜植株病毒癥狀表現(xiàn)不明顯，導(dǎo)致漏采。在所有檢測(cè)樣品中CMV的檢出率較高，可能是由于CMV寄主范圍廣，可侵染1 000多種單、雙子葉植物（王海河 等，2001），且CMV可由60多種蚜蟲進(jìn)行非持久性傳播，因此成為北京地區(qū)南瓜病毒病優(yōu)勢(shì)毒源。此外，本次采集樣本共84份，其中有79份病樣顯示陽性，5份疑似感染南瓜病毒病，但在該樣本內(nèi)未檢測(cè)到病毒，可能是生理性病害或藥害所致。

瓜類病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象在不同地區(qū)均有報(bào)道，部分學(xué)者對(duì)我國(guó)瓜類主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病毒種類調(diào)查，發(fā)現(xiàn)存在多種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象，其中以PRSV和WMV組合最為常見，占復(fù)合侵染組合的31.25%（尤毅 等，2016）；重慶地區(qū)南瓜檢測(cè)樣品中有93.22%的樣品受2種以上病毒復(fù)合侵染（青玲 等，2010）。本試驗(yàn)中2種病毒復(fù)合侵染率為16.67%，可能與連作、傳毒媒介、種子與土壤帶毒有關(guān)。尤其是昆蟲傳毒，CMV、ZYMV 、WMV均可通過蚜蟲進(jìn)行傳播，部分蚜蟲可攜帶多種病毒進(jìn)行再侵染，導(dǎo)致一種植株上出現(xiàn)2種或2種以上病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象。也可能與病毒越冬習(xí)性有關(guān)，如國(guó)內(nèi)學(xué)者在重慶地區(qū)對(duì)南瓜病毒病進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)農(nóng)田周圍葎草上存在7 種病毒，且復(fù)合侵染的比例高達(dá)80%（青玲 等，2009）。CMV、ZYMV和WMV均為種傳病毒（楊國(guó)慧，2003），再加上田間管理不當(dāng)、單一品種種植模式等，成為南瓜病毒病發(fā)生嚴(yán)重且存在復(fù)合侵染的主要原因。

本試驗(yàn)已檢測(cè)出北京地區(qū)南瓜病毒病的毒源種類主要有CMV、ZYMV和WMV，但受采集數(shù)量和地域性的限制，無法涵蓋北京地區(qū)南瓜病毒所有種類，因此，是否存在其他病毒種類還有待進(jìn)一步研究。

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