辣椒ToMMV的分子鑒定

陳靈芝張 茹魏兵強(qiáng)王蘭蘭高彥萍張 武

〔1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070；2甘肅省馬鈴薯脫毒種薯（種苗）病毒檢測及安全評價(jià)工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070〕

辣椒病毒病是近年來甘肅省辣椒生產(chǎn)中普遍發(fā)生的病害，植株一旦被病毒病感染，常表現(xiàn)為葉片皺縮、斑駁、黃化、花葉、壞死、畸形和植株矮化，且發(fā)病率極高，傳播迅速，易造成嚴(yán)重減產(chǎn)，產(chǎn)量損失達(dá)20%～70%。徐秉良（2001）報(bào)道侵染甘肅省辣椒的主要病毒為CMV，文朝慧等（2010）利用DAS-ELISA和RT-PCR法對甘肅省制種基地辣椒病樣進(jìn)行檢測，結(jié)果表明TMV和CMV是優(yōu)勢毒原種群，檢出率分別為44.4%和33.3%。

筆者多年來從事辣椒雜交育種工作，自2014～2016年在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗(yàn)地分別發(fā)現(xiàn)辣椒幼苗和成株疑似感染病毒病，主要癥狀表現(xiàn)為幼苗從第1片真葉畸形，葉片皺縮、黃化，個(gè)別植株生長點(diǎn)壞死。此后，隨著幼苗生長及定植，癥狀有所緩解，但在9、10月辣椒采收后期，葉片皺縮、黃化、畸形癥狀加重。對辣椒病毒病病原種類進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定是進(jìn)行有效防控和篩選抗毒種質(zhì)的前提。在參考前人對辣椒病毒病鑒定的工作基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以采集于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)地的病樣為材料，利用TMV/CMV雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒（DAS-ELISA）和RT-PCR方法進(jìn)行病原的檢測和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病毒病發(fā)病調(diào)查及樣品采集

2015年3月至2016年9月，在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚和試驗(yàn)田調(diào)查病毒病發(fā)生情況，并采集疑似感染病毒病的樣品。

2015年3月在育苗棚采集病樣25份，2016年3月和9月在育苗棚、試驗(yàn)田采集病樣47份，健康樣品5份，樣品保存于4 ℃冰箱和液氮中。分別進(jìn)行CMV/TMV雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DASELISA）檢測及RT-PCR檢測。

1.2 DAS-ELISA檢測

用于DAS-ELISA檢測的抗體及陽性、陰性對照樣品為美國Agdia公司產(chǎn)品。取采集到的新鮮待測樣品按0.1 g·mL-1加入樣品抽提緩沖液中充分研磨，將樣品、陽性對照及陰性對照分別加入到酶聯(lián)板反應(yīng)孔中，室溫條件下于黑暗潮濕環(huán)境中孵育2 h。具體檢測步驟參照產(chǎn)品說明書。

1.3 ToMMV分子鑒定

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)姚玉榮等（2013）、Li等（2014）以及Genbank數(shù)據(jù)庫中已公布的TMV和ToMMV的基因組全長序列，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)合成3對TMV引物和3對ToMMV引物（表1）。引物由生工生物工程技術(shù)（上海）有限公司合成。

1.3.2 總RNA的提取和cDNA的合成 采用天根生化科技（北京）有限公司總RNA提取試劑盒提取每個(gè)樣品中的總RNA，利用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：RNA模板2.5 μL，RNase Free ddH2O 4.0 μL，5×PrimerScript Buffer 2.0 μL，Random Primer 1.0 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL。反應(yīng)程序：37 ℃，15 min，85 ℃變性20 s，合成的cDNA用于后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.3.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 以反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增相應(yīng)病毒的序列。反應(yīng)體系：Mix（ 含 Mg2+，dNTP，buffer，Taq 酶 ）12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。

表1 用于RT-PCR反應(yīng)的辣椒病毒引物序列

1.3.4 序列分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的特異條帶切膠，采用天根生化科技（北京）有限公司的DNA回收試劑盒純化后與克隆載體PMD19連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TOP10，采用PMD19的通用引物對陽性克隆經(jīng)菌液鑒定后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。采用生物學(xué)軟件DNAMAN進(jìn)行核苷酸及編碼氨基酸序列的多重比對，系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）進(jìn)行，Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000。所用ToMMV參照分離物來源及序列登錄號(hào)見表2。

表2 用于序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析的ToMMV分離物來源和登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒病毒病發(fā)病情況

在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所育苗棚和試驗(yàn)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，辣椒病毒病普遍發(fā)生。苗期發(fā)病時(shí)期可提前至第1片真葉，表現(xiàn)為葉片上卷、畸形，隨著苗齡的增大，癥狀有所緩解，有的植株4～5層新葉表現(xiàn)為健康；定植后，隨著抗性的提高及田間病害防控，病情進(jìn)一步得到緩解；在采收后期，伴隨蟲害，病毒病發(fā)病嚴(yán)重，癥狀也復(fù)雜多樣，諸如明脈、斑駁、花葉、皺縮、畸形、黃化、壞死和矮化等（圖1）。

2.2 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測

采用CMV和TMV雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒對采集的辣椒病樣進(jìn)行檢測，TMV的總檢出率為66.7%，未檢出CMV（圖2）。

2.3 RT-PCR檢測

2.3.1 TMV擴(kuò)增結(jié)果 采用TMV雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒檢測出TMV的陽性率為66.7%，設(shè)計(jì)3對TMV引物對陽性病樣進(jìn)行擴(kuò)增，只有引物TMV1（姚玉榮，2013）在陽性樣品上擴(kuò)增出了預(yù)期大小的條帶，其他2對引物沒有擴(kuò)增出條帶（圖3）。對擴(kuò)增出的條帶經(jīng)回收、純化和克隆、測序（圖4、5），得到536 bp大小的序列片段，通過NCBI BLAST檢索證明與ToMMV（MX5，KF477193）達(dá)到97%的序列一致性。

圖1 辣椒病樣病毒病癥狀

圖2 CMV（左）和 TMV（右）的DAS-ELISA檢測

圖3 引物TMV1在辣椒病樣的擴(kuò)增

圖4 相似目的條帶切膠回收

圖5 陽性克隆的RT-PCR檢測

2.3.2 ToMMV擴(kuò)增結(jié)果 為了進(jìn)一步確認(rèn)病毒種類，針對ToMMV（MX5，KF477193）設(shè)計(jì)3對引物ToMMV1/ToMMVcp/ToMMVspe，ToMMV1擴(kuò)增的是ToMMV病毒CP基因的部分序列，ToMMVcp擴(kuò)增的是包括ToMMV病毒CP基因完整序列在內(nèi)的片段，ToMMVspe擴(kuò)增的是病毒基因組RNA酶復(fù)制區(qū)（nt830-1828），3對引物在陽性樣品上都擴(kuò)增出了預(yù)期大小的片段，ToMMV1擴(kuò)增出的條帶大小為550 bp，ToMMVcp擴(kuò)增出的條帶大小為850 bp，ToMMVspe擴(kuò)增出的條帶大小為1 000 bp（圖6），而3對引物在陰性樣品上均未擴(kuò)增出目的條帶（圖 7）。

圖6 引物TMV2、ToMMV1、ToMMVcp、ToMMVspe在陽性樣品上的RT-PCR擴(kuò)增

圖7 引物TMV2、ToMMV1、ToMMVcp、ToMMVspe在陰性樣品上的RT-PCR擴(kuò)增

2.4 ToMMV 的CP基因序列比對及分析

挑選3個(gè)分離物，分別命名為Gansu-1、Gansu-2、Gansu-3，對其擴(kuò)增的完整CP基因核苷酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，核苷酸序列相似性為99.2%～99.6%。將3個(gè)分離物與GenBank中已報(bào)道的11個(gè)ToMMV CP基因（表2）核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比較，核苷酸和氨基酸序列同源性均達(dá)到98%以上。

在基于ToMMV CP基因氨基酸的進(jìn)化樹（圖8）中，本試驗(yàn)中得到的3個(gè)分離物和下載的11個(gè)ToMMV CP基因氨基酸可聚為2類，2個(gè)來自以色列的ToMMV聚為一類，其余9個(gè)ToMMV和分離物Gansu-1、 Gansu-2、Gansu-3聚為一類，其中分離物Gansu-1和來自中國的TiLhaLJ關(guān)系較近，分離物Gansu-2和來自美國的S13-5聚為緊密的一族，分離物Gansu-3和來自美國的CA16-01聚為緊密的一族。

圖8 基于ToMMV CP基因氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的成員為棒狀結(jié)構(gòu)，很容易通過植物之間的接觸和機(jī)械接種傳播，種子也可傳播病毒。煙草花葉病毒屬有33個(gè)種，這33個(gè)種在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，其中TMV是第1個(gè)被鑒定的（Jacobi et al.，1998；Fillmer et al.，2015）。煙草花葉病毒屬基因組編碼4個(gè)蛋白，編碼1個(gè)126 kD和1個(gè)183 kD復(fù)制需要的蛋白，還編碼1個(gè)30 kD 的運(yùn)動(dòng)蛋白和1個(gè)17.5 kD的外殼蛋白（Kumar et al.，2011）。ToMMV是煙草花葉病毒屬中1個(gè)新發(fā)現(xiàn)的病毒，于2013年首次在墨西哥報(bào)道（Li et al.，2013），繼而在美國發(fā)現(xiàn)（Webster et al.，2014）。中國于2015年報(bào)道在云南、拉薩等地有ToMMV侵染辣椒（Li et al.，2014）。ToMMV侵染辣椒的癥狀為葉片斑駁花葉，皺縮和壞疽。

本試驗(yàn)對甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚和試驗(yàn)地病毒病病原種類進(jìn)行了DASELISA鑒定，檢測出TMV的侵染率高達(dá)66.7%。為了從分子層面進(jìn)一步確認(rèn)TMV病毒，在隨后的RT-PCR擴(kuò)增中，設(shè)計(jì)了3對TMV引物，卻只有TMV1在陽性樣品上擴(kuò)增出了與目的片段大小相似的條帶，其他2對引物沒有擴(kuò)增出條帶。通過用瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物分離后，選取目的條帶回收后連接到載體上，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，將陽性克隆測序后經(jīng)NCBI BLAST檢索證明與ToMMV（MX5，KF477193）序列一致性達(dá)到97%。隨后針對ToMMV（MX5，KF477193）進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物，證明在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒育苗棚和試驗(yàn)地的病毒病病原種類為ToMMV。選取3個(gè)分離物CP基因氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明其中的2個(gè)分離物與來源于中國的2個(gè)分離物 YYMLJ（KR824951.1）、TilhaLJ（KR824951.1）關(guān)系較近。

本試驗(yàn)中使用TMV DAS-ELISA檢測試劑盒和試紙條（試驗(yàn)結(jié)果未列出）均在病樣上檢測出陽性結(jié)果，但通過RT-PCR技術(shù)證明病毒種類為ToMMV，進(jìn)一步說明煙草花葉病毒屬的成員之間的交叉反應(yīng)影響DAS-ELISA檢測過程中對病原的準(zhǔn)確診斷。

文朝慧，劉志杰，張麗萍，劉箐，王軍平，劉雅莉，宋蕤，施穎波，侯健雄.2010.甘肅省河西地區(qū)辣（甜）椒病毒病毒原鑒定.中國蔬菜，（16）：74-78.

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