黃瓜果刺大小遺傳分析

狄勝強(qiáng) 李 豪 欒倩倩 王麗娜 李 強(qiáng) 任仲海

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室，作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，山東泰安 271018）

黃瓜刺瘤密度及大小決定了黃瓜果實的光滑程度。黃瓜刺瘤由果刺和果瘤兩種結(jié)構(gòu)組成，而果刺又包括上部單細(xì)胞針狀刺和下部多細(xì)胞球狀基座（Yang et al.，2014）。多細(xì)胞基座決定果刺大小，當(dāng)基座小到一定程度時，果刺即成為小且柔軟的毛刺，這時黃瓜果實也表現(xiàn)為光滑的外觀性狀。目前對黃瓜刺瘤的研究主要集中在刺瘤的有無及密度方面（楊雙娟 等，2011；Li et al.，2015；Pan et al.，2015；Zhang et al.，2016；Xie et al.，2018）， 雖 然已有對小刺基因定位的報道（杜輝，2008），但是果刺大小的遺傳規(guī)律仍不清楚。

曹辰興和郭紅蕓（1999）報道了無刺黃瓜自然突變體（glabrous 1，gl1），該突變體地上部均無毛，葉片有光澤。接著，曹辰興等（2001）對無刺基因（gl1）與果瘤基因（Tu-tu）的關(guān)系進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)果刺和果瘤基因互作可產(chǎn)生有瘤有刺、無瘤有刺、無瘤無刺3種黃瓜類型，表明gl1對果瘤基因存在隱性上位作用。果瘤基因Tu編碼1個C2H2型鋅指蛋白，通過促進(jìn)CTK（細(xì)胞分裂素）的合成誘導(dǎo)果瘤發(fā)育（Zhang et al.，2010；Yang et al.，2014）。Li等（2015）利用 gl1 突變體，定位并克隆了CsGL1，該基因編碼HD-ZIPⅠ亞家族的1個轉(zhuǎn)錄因子。楊雙娟等（2011）利用葉片無毛突變體NCG-042，以F2世代為作圖群體初步將無毛基因gl-2定位在黃瓜2號染色體上?？刂泣S瓜果刺和毛狀體起始及發(fā)育的CsGL3也已被克隆，該基因編碼HD-ZIPⅣ亞家族的1個轉(zhuǎn)錄因子，并被證明是CsGL1的上位基因（Pan et al.，2015；Cui et al.，2016）。CsGL3基因還參與調(diào)控黃瓜果刺密度，其啟動子區(qū)的812 bp片段替換是決定黃瓜果刺密度的關(guān)鍵因素（Zhang et al.，2016）。轉(zhuǎn)基因分析表明WD40家族基因CsTTG1也可以調(diào)控黃瓜刺瘤大小和密度（Chen et al.，2016），且是獨(dú)立于CsGL1的途徑來調(diào)控果刺及蠟粉腺毛的起始和發(fā)育。另一個調(diào)控果刺密度的基因ns （Csa2M264590）也已被克隆，功能注釋表明，該基因?qū)儆贏ux/Lax家族，編碼類似生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3，參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Xie et al.，2018），NS負(fù)調(diào)控果刺密度。黃瓜小刺基因（ss）只有初步的定位結(jié)果（杜輝，2008）。

黃瓜果刺對保護(hù)果實免受病蟲及紫外線等的傷害具有一定作用。黃瓜多細(xì)胞果刺的發(fā)育機(jī)制與擬南芥中單細(xì)胞表皮毛發(fā)育機(jī)制有著顯著的不 同（Hülskamp et al.，1999；Hülskamp，2004；Schellmann & Hülskamp，2005；Li et al.，2015）。黃瓜果刺大小遺傳規(guī)律分析與基因挖掘，有助于闡明多細(xì)胞果刺發(fā)育機(jī)制，也對黃瓜果實光滑性狀的改良具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

本試驗以大果刺黃瓜自交系CNS5和小果刺黃瓜自交系RNS4為親本，構(gòu)建了P1、F1、P2、B1、B2和F26世代群體，利用主基因+多基因混合遺傳模型（蓋鈞鎰 等，2003），對黃瓜果刺大?。ɑ睆剑┑倪z傳規(guī)律進(jìn)行初步分析，以期為制定果刺大小相關(guān)基因定位策略提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用親本材料P1和P2分別為CNS5和RNS4，均為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜分子遺傳學(xué)實驗室保存的中國華北型黃瓜自交系。親本CNS5果刺大，RNS4果刺小，兩親本間果刺基座大小差異明顯（圖1）；2015年秋季將兩親本種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站溫室，雜交獲得子代F1（CNS5×RNS4）和 F1′（RNS4×CNS5）。2016年春季種植 F1，自交獲得子代F2，同時用2個親本分別與F1回交獲得回交群體B1（CNS5/RNS4//CNS5）和B2（CNS5/RNS4//RNS4）。以此獲得CNS5和RNS4雜交組合的 6 個世代群體，即 P1、F1、P2、B1、B2和 F2。

圖1 親本及F1的幼果和兩親本果刺基座對比

1.2 田間試驗

2016年秋季及2017年春季分別將6個世代群體種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站拱棚。播種前施腐熟農(nóng)家肥。株距40 cm，行距50 cm，每行10株，生育期田間正常水肥管理，及時除草，防治病蟲害。選取開花當(dāng)天順直無畸形的幼果，去掉頂花，拍照后用于果刺基座測量，每株取3個幼果，即為3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 黃瓜果刺測量部位及測量時期

黃瓜果刺的發(fā)育是一個循序漸進(jìn)的過程，因而確定具體的測量部位和測量時期對表型鑒定起著至關(guān)重要的作用。依據(jù)Chen等（2016）介紹的方法，本試驗將果刺基座直徑的測量部位確定為幼果中間部分（圖2）。該部位的果刺形狀整齊、規(guī)則，能夠代表整瓜的果刺大小。

圖2 黃瓜幼果果刺基座測量部位及局部放大圖

兩親本的果刺發(fā)育進(jìn)程統(tǒng)計表明（圖3），黃瓜雌花幼果開花前是黃瓜果刺的快速發(fā)育期，果刺（主要是基座）急劇膨大，至開花當(dāng)天果刺發(fā)育基本達(dá)到最大，開花后果刺膨大趨于平緩。鑒于開花當(dāng)天（0 DAA）的幼果花瓣完全展開，顏色鮮艷黃亮，是黃瓜幼果發(fā)育階段最易辨識的形態(tài)標(biāo)記；且果刺已過了快速膨大期，能夠代表黃瓜果實的果刺大??；統(tǒng)一將開花當(dāng)天的黃瓜幼果確定為果刺表型鑒定的最佳時期，力求表型鑒定的準(zhǔn)確性與可靠性。

圖3 黃瓜果刺發(fā)育過程

1.4 果刺基座測量方法

果刺基座測量所用的軟件為Image J，使用默認(rèn)參數(shù)（Pascau & Mateos，2013），其步驟為：①雙擊打開Image J，進(jìn)入File菜單，選擇Open導(dǎo)入目標(biāo)照片。② 通過Ctrl+來調(diào)節(jié)照片大小至200%且果刺基座輪廓清晰。③ 定義工具欄上點(diǎn)選直線工具圖標(biāo)，在照片中直尺上對應(yīng)長度畫1條直線，進(jìn)入Analyze菜單，點(diǎn)擊Set Scale，設(shè)定照片中相對比例的實際大小。Distance in pixels為照片中的直線長度，Known distance為實際的直線長度。④ 在幼果中間部位，選擇圓形規(guī)則的果刺基座，直線垂直測量果刺基座直徑（圖2），通過快捷鍵Ctrl+M統(tǒng)計所選的果刺基座直徑。⑤ 每個果實測量10個果刺，統(tǒng)計完成后將數(shù)據(jù)儲存為 *.xlsx文件。

1.5 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)整理采用軟件Microsoft Excel 2007，基本參數(shù)統(tǒng)計、差異顯著性比較使用軟件DPS7.05（唐啟義和馮明光，2007），多世代頻率作圖及曲線擬合采用軟件Origin Pro 2016（葉衛(wèi)平，2015）。使用由蓋鈞鎰和章元明等提出的主基因+多基因混合遺傳模型分離分析法對6世代P1、F1、P2、B1、B2和F2進(jìn)行聯(lián)合分析。通過極大似然分析和IECM（Iterated expectation and conditional maximization）算法估計混合分布中的相關(guān)分布參數(shù)（章元明和蓋鈞鎰，2000），再依據(jù) AIC（Akaike’s information criterion）值最小原則選擇最佳模型并進(jìn)行適合性檢驗，包括均勻性U12、U22和U32檢驗，Smirnov檢驗（nW2）和Kolmogorov檢驗（Dn），選擇最優(yōu)模型。最后采用最小二乘法依據(jù)最優(yōu)模型的各成分分布參數(shù)估計遺傳參數(shù)。遺傳分析R語言優(yōu)化軟件包SEA1.0由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)章元明教授惠贈。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

2.1.1 果刺基本參數(shù) 親本CNS5（P1）果刺大且多（圖1-B），親本RNS4（P2）果刺小且少（圖1-C），幼果大小差異不大，F(xiàn)1果刺大?。ɑ睆剑┙橛趦捎H本之間。統(tǒng)計結(jié)果表明，P1、P2與F1相互之間果刺大小差異極顯著，適合進(jìn)行遺傳特性分析（圖4）。

圖4 親本與雜交一代果刺基座直徑統(tǒng)計

由表1可知，各世代變異系數(shù)均小于15%，說明數(shù)據(jù)精度符合進(jìn)一步分析的要求。2016年秋季和2017年春季各世代種植分離群體中，F(xiàn)1果刺大小均介于兩親本之間。B1、B2和F2果刺大小也介于兩親本P1與P2之間（表1）。連續(xù)兩年的F1果刺大小基本一致且都介于兩親本之間，說明控制果刺大小的等位基因不是簡單的顯隱性關(guān)系。

2.1.2 分離世代次數(shù)分布及曲線擬合 由分離世代可知，在2016年秋季群體中，50株B1和48株B2世代的分離值都介于兩親本之間，而在102株的F2群體中出現(xiàn)最小的果刺基座，為0.61 mm，雖然小于P2的最小果刺基座0.63 mm，但仍在誤差范圍之內(nèi)，應(yīng)該不是負(fù)向超親優(yōu)勢（表1）。2017年春季群體中，B1中最大果刺基座為1.19 mm，高于當(dāng)年親本P1的最大果刺基座1.10 mm，雖差異明顯，但群體中僅有2株，不足以說明存在正向超親優(yōu)勢（表1）。果刺基座表型值連續(xù)分布，對各分離世代的頻率分布進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果表明，2016年秋季和2017年春季的果刺基座表型值在各分離世代B1、B2和F2中均表現(xiàn)出正態(tài)分布（圖5），呈現(xiàn)數(shù)量遺傳特征。

表1 CNS5×RNS4 6世代果刺基座直徑基本參數(shù)統(tǒng)計

圖5 2016年秋季和2017年春季果刺大小頻率分布

2.2 果刺大小主基因+多基因遺傳模型分析

2.2.1 果刺大小遺傳模型選擇 利用主基因+多基因混合遺傳模型的6世代（P1、F1、P2、B1、B2和F2）聯(lián)合分析法，估算出果刺大小的5類24種遺傳模型的極大似然函數(shù)值和AIC值（表2）。根據(jù)最佳模型的AIC值最小原則從表2中選出AIC值最小的模型以及與最小AIC值最接近的1個遺傳模型作為備選模型。即在2016年秋季AIC值最小為-580.5的C-0模型作為可能的最佳候選模型，接近最小AIC值-576.5的D-0模型為備選模型。2017年春季C-0模型的AIC值最小，為-1 422.5，也作為可能的最佳候選模型，AIC值為-1 418.5的D-0模型作為備選模型（表2）。

表2 CNS5×RNS4組合后代各遺傳模型的AIC值

2.2.2 果刺大小候選模型的適合性檢驗 對選出的候選模型進(jìn)行均勻性檢驗，Smirnov（nW2）檢驗和 Kolmogorov（Dn）檢驗（表3），選出統(tǒng)計量達(dá)顯著水平個數(shù)較少的模型為最優(yōu)模型。結(jié)果表明，2016年秋季群體中，C-0和D-0模型中沒有統(tǒng)計量的差異達(dá)到顯著水平。2017年春季群體中，C-0和D-0模型中均有1個檢驗統(tǒng)計量差異達(dá)到顯著水平。再結(jié)合AIC值最小原則，選擇C-0作為連續(xù)兩年的果刺大小最優(yōu)遺傳模型，即為典型的加性-顯性-上位性多基因混合遺傳模型，無主基因存在，多基因加性和顯性效應(yīng)、上位性效應(yīng)累計均為正向。

表3 CNS5×RNS4群體適合性檢驗

2.2.3 果刺大小遺傳參數(shù)估計 對適合果刺大小的C-0模型進(jìn)行遺傳參數(shù)估計，一階遺傳參數(shù)結(jié)果表明，2016年秋季和2017年春季的6個世代群體的平均值差異不大（表4）。從二階遺傳參數(shù)的估計值可以看出（表5），2016年秋季B1、B2和F2群體中，果刺大小多基因遺傳方差分別為0.001 1、0.003 2和0.006 3；多基因遺傳率分別為40.06%、65.91%和79.21%，環(huán)境方差占表型方差的值分別為59.94%、34.09%和20.79%。在2017年春季的B1群體中多基因遺傳方差為0.004 9，多基因遺傳率為71.13%，環(huán)境方差占表型方差的28.87%；B2群體的多基因遺傳方差為0.005 2，多基因遺傳率為72.46%，環(huán)境方差占表型方差的27.54%；F2群體的多基因遺傳方差為0.004 9，多基因遺傳率為71.25%，環(huán)境方差占表型方差的28.75%。由此可見，該群體中果刺大小的多基因遺傳率較高，無主效基因存在，受環(huán)境影響相對較小。在遺傳育種上，應(yīng)將早代選擇和高代選擇相結(jié)合。在基因定位策略選擇上不宜利用F2世代分離群體進(jìn)行定位，結(jié)合高代回交群體進(jìn)行基因定位效果可能會更好。

表4 CNS5×RNS4 雜交組合果刺大小的一階遺傳參數(shù)估計值（C-0模型）

表5 CNS5×RNS4 雜交組合果刺大小的二階遺傳參數(shù)估計值（C-0模型）

3 結(jié)論與討論

主基因+多基因混合遺傳模型是由蓋鈞鎰等提出的數(shù)量性狀遺傳分析方法，在大豆（劉陽 等，2016）、小麥（李樹華 等，2017）、水稻（鄭燕 等，2011）、黃瓜（曹明明 等，2018）、油菜（汪文祥等，2016）、胡麻（化青春 等，2016）等多種作物的遺傳研究中得到了廣泛的應(yīng)用。本試驗利用主基因+多基因混合遺傳模型分析法，對2016年秋季和2017年春季2個生長季節(jié)的6世代群體P1、F1、P2、B1、B2和F2的黃瓜果刺大小的遺傳規(guī)律進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，F(xiàn)1的果刺大小介于兩親本之間。F2分離群體果刺大小表現(xiàn)為無明顯分組的連續(xù)變異，基本符合正態(tài)分布，屬于數(shù)量性狀。其遺傳模型符合C-0模型，即加性-顯性-上位性多基因混合遺傳模型，多基因加性和顯性效應(yīng)均為正向，多基因遺傳力相對較高，存在多基因聯(lián)合效應(yīng)，且微效基因數(shù)目較多，受環(huán)境影響也相對較小。連續(xù)兩季的F2多基因遺傳率分別為79.21%和71.25%，多基因遺傳率較高且相差不大；與2016年秋季結(jié)果相比，2017年春季B1和B2群體的多基因遺傳率更高，且差異不大。這可能與2017年春季群體較大，變異相對穩(wěn)定有關(guān)，相應(yīng)地，所得結(jié)果也更可靠。在遺傳育種上，應(yīng)將早代選擇和高代選擇相結(jié)合。在基因定位方面不宜利用F2分離群體進(jìn)行定位，結(jié)合高代回交群體或者利用存在主效基因的群體定位果刺大小相關(guān)基因效果可能會更好。

對比連續(xù)兩季3個分離群體B1、B2和F2的果刺大小變化范圍（表1），可以發(fā)現(xiàn)，2016年秋季幾乎沒有出現(xiàn)大于親本P1和小于親本P2的極端表型值，而2017年春季有個別大于親本P1的極端表型值。一方面，可能是由于隨著種植群體的加大，果刺大小的極端值出現(xiàn)的幾率增大；另一方面，也可能是由于春季溫度較高，使得分離群體出現(xiàn)極端值的幾率增大，可見環(huán)境對試驗結(jié)果的影響也不容忽視。

黃瓜果刺隨著前期果實的快速生長而同步膨大，至開花當(dāng)天達(dá)到最大，之后不再膨大。但據(jù)筆者觀察，有的黃瓜品種隨著果實發(fā)育成熟果刺有變小的現(xiàn)象。黃瓜開花后，在成熟過程中黃瓜的主要生長中心逐漸轉(zhuǎn)向果實的膨大和種子的成熟，大量的養(yǎng)分運(yùn)往果實或種子用于生長，作為外在保護(hù)性器官的果刺不再是主要的生長中心，從而失去了縱向和橫向繼續(xù)生長能力。受外在溫度、水分等脅迫的影響，果刺有失水縮小、硬化等現(xiàn)象。果實發(fā)育成熟果刺變小的這種現(xiàn)象除與品種、栽培條件有關(guān)外，可能也有相應(yīng)的基因控制該進(jìn)程。因此選擇開花當(dāng)天鑒定果刺表型結(jié)果相對準(zhǔn)確。

多基因控制的數(shù)量性狀受環(huán)境的影響較大，不同的栽培環(huán)境如溫度、濕度等的不同變化會導(dǎo)致較大的差異。2016年秋季群體（圖5）的頻次分布可能由于群體較小，受極端天氣的影響以及分組太大導(dǎo)致統(tǒng)計差異比較大，表現(xiàn)為不是特別典型的正態(tài)分布。果刺基座本身就小，有時拍照時的環(huán)境光線不穩(wěn)定，部分照片質(zhì)量會受到影響，會對部分?jǐn)?shù)據(jù)的統(tǒng)計造成較大誤差。2017年春季B1、B2和F2群體的頻率分布則更傾向于正態(tài)分布（圖5）。由此可知，群體越大所得結(jié)果也相對更可靠。數(shù)量性狀的表型效應(yīng)是與環(huán)境共同作用的結(jié)果，無論其相關(guān)基因表現(xiàn)為主效基因還是多效基因，都與環(huán)境的互作有關(guān)（向道權(quán) 等，2001）。

主基因+多基因混合遺傳模型是研究數(shù)量性狀遺傳規(guī)律的一種有力工具，依據(jù)作物表型值分析遺傳規(guī)律。該體系綜合了其他經(jīng)典遺傳學(xué)的優(yōu)勢，可以進(jìn)行單個數(shù)量性狀基因鑒別研究，包含多種類型，依不同群體使用對應(yīng)的類型，容易操作，可以區(qū)分出數(shù)個主基因數(shù)量和效應(yīng)。目前為止最多可預(yù)測到兩對主效基因和相應(yīng)的遺傳率，但是當(dāng)群體預(yù)測處在微效多效基因區(qū)時，與經(jīng)典遺傳學(xué)無異，只能預(yù)測多基因的遺傳效率，卻預(yù)測不到更多更具體的多基因數(shù)量（劉陽 等，2016）；不同群體中，同一性狀的不同類型會有不同的表現(xiàn)，這是該模型的局限所在（狄佳春 等，2016）。盡管如此，該模型在多種作物中的廣泛使用和所得結(jié)果為其數(shù)量性狀育種的選育時期、QTL基因定位策略的制定提供了重要的參考。對該體系的進(jìn)一步優(yōu)化和發(fā)展（章元明，2012），增加主效基因的預(yù)測數(shù)量并提高其預(yù)測的準(zhǔn)確性和精確性，也會為遺傳育種工作者提供更可靠、更精準(zhǔn)的數(shù)量遺傳信息。

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