ω-轉(zhuǎn)氨酶不對(duì)稱合成手性胺及非天然氨基酸的研究進(jìn)展

程 峰，相 超，王亞軍

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014)

手性胺是指小分子化合物手性中心含有氨基的一類化合物，是眾多醫(yī)藥及農(nóng)藥的關(guān)鍵中間體，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位[1-2]。例如，糖尿病類治療藥物——西他列汀(Merck公司及Codexis公司)及廣譜觸殺型除草劑——草銨膦(Bayer公司)都具有手性胺化學(xué)模塊。

目前，化學(xué)法、生物拆分法和生物不對(duì)稱合成法是制備手性胺的主要方法?；瘜W(xué)法合成手性胺往往需要使用昂貴的金屬催化劑及特制的溶劑，生產(chǎn)成本較高，對(duì)映選擇性較低，并會(huì)造成一定的環(huán)境污染；生物催化劑進(jìn)行手性拆分法制備高純度手性胺的最大理論收率只有50%(圖1(a))[3]。因此，這兩種方法都不能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。生物法生產(chǎn)手性胺的首選策略為不對(duì)稱合成，其理論收率高達(dá)100%(圖1(b))，使其在生產(chǎn)工業(yè)領(lǐng)域有著強(qiáng)大的應(yīng)用前景，相關(guān)研究受到了廣泛的重視。針對(duì)氨基轉(zhuǎn)移可逆的特點(diǎn)，通過一些策略可以將反應(yīng)平衡向胺生成的方向移動(dòng)，能夠顯著提高手性胺的生產(chǎn)效率。

本文中，筆者介紹ω-轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)特征，并以制備西他列汀中間體等為例，闡述了ω-轉(zhuǎn)氨酶的高通量篩選方法及分子改造的研究進(jìn)展及通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)提高手性胺產(chǎn)量的策略。最后，綜述了ω-轉(zhuǎn)氨酶在不對(duì)稱合成非天然氨基酸中的具體應(yīng)用。

圖1 酶法動(dòng)力學(xué)拆分(a)與不對(duì)稱合成(b)制備手性胺的基本原理Fig.1 Principles of chiral amines synthesis by kinetic bio-resolution (a) and asymmetric synthesis (b)

1 ω-轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及催化機(jī)制

轉(zhuǎn)氨酶(transaminase,TA,EC 2.6.1.X)，又稱氨基轉(zhuǎn)移酶(aminotransferase)，屬于轉(zhuǎn)移酶類，能夠可逆催化酮基與氨基之間的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。當(dāng)這類酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中，底物或產(chǎn)物含有α-氨基酸時(shí)，就稱該酶為α-轉(zhuǎn)氨酶，反之則稱之為ω-轉(zhuǎn)氨酶[1]。α-轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)物一般只是α-氨基酸，而ω-轉(zhuǎn)氨酶能夠氨基化酮酸、醛和酮，且具有立體選擇性高、輔因子可再生的特點(diǎn)，因此，ω-轉(zhuǎn)氨酶被更廣泛地應(yīng)用于合成醫(yī)藥和農(nóng)藥中間體[4]。

1.1 ω-轉(zhuǎn)氨酶的三維結(jié)構(gòu)特征

ω-轉(zhuǎn)氨酶為磷酸吡哆醛(PLP)依賴型酶，通過不對(duì)稱催化還原胺酮合成手性胺，通常使用丙氨酸或異丙胺作為氨基供體。根據(jù)一般規(guī)律，使用D-丙氨酸作為氨基受體的ω-轉(zhuǎn)氨酶為(R)-型轉(zhuǎn)氨酶，屬于Ⅳ類折疊(圖2(a))；而使用L-丙氨酸為氨基供體的ω-轉(zhuǎn)氨酶為(S)-型轉(zhuǎn)氨酶，屬于Ⅰ類折疊(圖2(b))。這兩類折疊的ω-轉(zhuǎn)氨酶有著不同的序列長(zhǎng)度、不同的折疊方式，缺乏整體序列相似性，因此，它們的進(jìn)化是分開進(jìn)行的[5]。

圖2 (R)-型轉(zhuǎn)氨酶的三維結(jié)構(gòu)一般特征(a)(PDB:4CMD),(S)-型轉(zhuǎn)氨酶的三維結(jié)構(gòu)一般特征(b) (PDB:4BA5)及兩種轉(zhuǎn)氨酶底物結(jié)合口袋的一般結(jié)構(gòu)(c)Fig.2 3D structure of (R)-selective transaminase(a)(PDB:4CMD),(S)-selective transaminase(b)(PDB:4BA5),and the structural feature of active sites in (R)- and (S)-transaminases(c)

盡管這兩類轉(zhuǎn)氨酶有以上的不同特征，但是雙底物識(shí)別是它們的一個(gè)共同特點(diǎn)。所有已知的野生型TAs的活性中心都由1個(gè)大口袋和1個(gè)小口袋組成，親水和疏水基團(tuán)的底物都可以結(jié)合到轉(zhuǎn)氨酶兩個(gè)口袋中(圖2(c))。在兩個(gè)口袋中，這兩類ω-轉(zhuǎn)氨酶的關(guān)鍵催化氨基酸殘基有著相同的空間排列，而且都具有高度保守的賴氨酸殘基。有研究者對(duì)一些(S)-TAs結(jié)構(gòu)和(R)-TAs結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，提出了關(guān)于TAs在活性位點(diǎn)處可接受疏水性和親水性底物的相關(guān)理論[6]。研究者認(rèn)為，(S)-轉(zhuǎn)氨酶通過“翻轉(zhuǎn)”活性位點(diǎn)附近的一個(gè)“環(huán)”結(jié)構(gòu)上的精氨酸殘基，對(duì)活性部位的胍基部分進(jìn)行移動(dòng)，使底物的羧基部分可以進(jìn)入活性口袋進(jìn)行反應(yīng)；在需要疏水環(huán)境時(shí)，將胍基部分移動(dòng)出活性部位以提供疏水環(huán)境，這一過程在雙底物識(shí)別過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。例如，來自Chromobacteriumviolaceum的(S)-TA的Arg129位點(diǎn)[7]。而對(duì)于(R)-TA，同樣是一個(gè)位于活性部位附近的精氨酸殘基顯示類似的功能：Aspergillusfumigatus中(R)-TA的Arg126位點(diǎn)和Aspergillusterreus中(R)-TA的Arg128位點(diǎn)[8]。但是，目前已發(fā)現(xiàn)的大部分野生型ω-轉(zhuǎn)氨酶的小口袋只能容納1個(gè)甲基[1]，這嚴(yán)重影響了其對(duì)大體積底物的催化活性。

1.2 ω-轉(zhuǎn)氨酶的基本催化機(jī)制

針對(duì)ω-轉(zhuǎn)氨酶雙底物識(shí)別的特征，目前公認(rèn)的反應(yīng)機(jī)制主要包括兩步半反應(yīng)的Ping-Pong Bi-Bi機(jī)制(圖3)。在第一個(gè)半反應(yīng)中，酶與PLP結(jié)合(E:PLP)形成內(nèi)部醛亞胺結(jié)構(gòu)，同時(shí)催化中心的賴氨酸親核攻擊氨基供體產(chǎn)生外部醛亞胺結(jié)構(gòu)；接著，中性賴氨酸殘基釋放，平面醌類中間體催化內(nèi)部氫重排，產(chǎn)生酮亞胺。在第二個(gè)半反應(yīng)中，酮亞胺水解，釋放產(chǎn)物酮并產(chǎn)生復(fù)合體酶：吡哆胺5′-磷酸(E:PMP)；然后，在E:PMP和底物酮之間形成酮亞胺絡(luò)合物，其最終經(jīng)由第二平面醌型中間體和外部醛亞胺再生E:PLP，并最終釋放出產(chǎn)物——手性胺[1,9]。

圖3 ω-轉(zhuǎn)氨酶催化不對(duì)稱合成手性胺的雙底物乒乓機(jī)制Fig.3 Principles of asymmetric synthesis of chiral amines by ω-transaminase(Ping-Pong Bi-Bi mechanism)

2 ω-轉(zhuǎn)氨酶的篩選及改造

酶法制備光學(xué)純手性胺的關(guān)鍵在于獲得高活力與高選擇性兼?zhèn)涞摩?轉(zhuǎn)氨酶。但由于ω-轉(zhuǎn)氨酶種類相對(duì)偏少，底物譜窄，因此，通過篩選或改造得到性質(zhì)優(yōu)良的ω-轉(zhuǎn)氨酶非常重要。近年來，許多研究集中在篩選新型ω-轉(zhuǎn)氨酶，通過改造ω-轉(zhuǎn)氨酶關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域增大其底物譜等方面，而且這些研究也取得了一定的突破[1-2]。

2.1 ω-轉(zhuǎn)氨酶的篩選

ω-轉(zhuǎn)氨酶的篩選方法主要分為傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)篩選方法和計(jì)算機(jī)篩選方法。前者首先需要對(duì)微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，進(jìn)而通過使用唯一氮源篩選得到活性以及選擇性強(qiáng)的轉(zhuǎn)氨酶。目前，通過該方法發(fā)現(xiàn)的ω-轉(zhuǎn)氨酶序列具有較大差異，如使用(S)-α-甲基芐基胺為唯一氮源篩選得到KlebsiellapneumoniaJS2F、BacillusthuringiensisJS64及VibriofluvialisJS17等菌株。從這些菌株中克隆得到的ω-轉(zhuǎn)氨酶氨基酸序列一致性小于50%，可以說明ω-轉(zhuǎn)氨酶來源較為廣泛。而且這種篩選方法在實(shí)際操作過程中大多以L-丙氨酸為氨基供體，得到的ω-轉(zhuǎn)氨酶絕大多數(shù)是(S)-選擇性[4]。盡管大量的努力來篩選，但是目前只有少數(shù)幾個(gè)ω-轉(zhuǎn)氨酶是R-選擇性，如來自Aspergillusterreus菌的ω-轉(zhuǎn)氨酶(PDB：4CE5)[10]。因此，傳統(tǒng)篩選難以快速獲得(R)-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶。

針對(duì)這一問題，有研究者開發(fā)出計(jì)算機(jī)虛擬篩選(R)-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶。計(jì)算機(jī)篩選方法是使用生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)等手段在已有的數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)酶進(jìn)行篩選和分析，通過序列對(duì)比、建模對(duì)酶活性位點(diǎn)對(duì)比分析以及基序搜索等方法，從基因序列中篩選可能具有活性的酶基因。2010年，德國(guó)Bornscheuer教授課題組的H?hne等[3]成功開發(fā)出一種基于序列-底物特異性和立體選擇性的程序，預(yù)測(cè)功能未知的(R)型選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶。首先，他們通過替換活性位點(diǎn)關(guān)鍵的氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)并且預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)活性。然后，通過數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行搜索并獲得攜帶突變的相似蛋白，這樣可以充分利用經(jīng)過數(shù)百萬(wàn)年的自然進(jìn)化選擇的蛋白質(zhì)而非重新設(shè)計(jì)蛋白。使用這種策略,他們成功從5 700個(gè)序列中鑒定出21個(gè)(R)-選擇性的TA。其中，17個(gè)ω-轉(zhuǎn)氨酶在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中顯示出(R)-選擇性的轉(zhuǎn)氨活力。最終，7個(gè)(R)-ω-轉(zhuǎn)氨酶被成功應(yīng)用于合成 (R)-的脂肪族和芳香族類的手性胺。類似地，Iglesias等[11]利用這種基因挖掘的方法，成功獲得了來源于Caproniasemiimmersa的(R)-ω-轉(zhuǎn)氨酶，當(dāng)以芐基丙酮或乙酰苯作為底物時(shí)，該酶顯示了很好的立體選擇性(對(duì)于這兩個(gè)底物，該酶的對(duì)映體選擇率(E)>200，產(chǎn)物的對(duì)映體過量值e.e.>99%)。

2.2 ω-轉(zhuǎn)氨酶改造

針對(duì)天然的ω-轉(zhuǎn)氨酶底物譜較窄及其立體選擇性單一(基本是(S)-型)的特點(diǎn)，近年來，有較多關(guān)于ω-轉(zhuǎn)氨酶改造的報(bào)道，特別在酶的立體選擇性及底物特異性方面。應(yīng)用改造后的轉(zhuǎn)氨酶獲得與醫(yī)藥中間體模塊的大型手性胺和(R)型立體選擇性手性胺，這是一種非常具有前景的合成方法[12]。

2.2.1 改造ω-轉(zhuǎn)氨酶改變其立體選擇性

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量編碼ω-轉(zhuǎn)氨酶的基因，這些編碼基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)ω-轉(zhuǎn)氨酶合成不同的手性胺起到了巨大的推動(dòng)作用[2]。最著名的改造ω-轉(zhuǎn)氨酶立體選擇性的例子是2011年美國(guó)Codexis公司對(duì)來自Arthrobactersp.的ATA117進(jìn)行的改造。在引入27個(gè)突變點(diǎn)后成功得到ATA117-Rd11這一突變蛋白，其立體選擇性改變?yōu)閲?yán)格的(R)型。該突變體酶能夠催化西他列汀前體酮不對(duì)稱合成糖尿病類治療藥物西他列汀(一種R-構(gòu)型手性胺)[13]。改造中的涉及27個(gè)突變主要集中在3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域： ①底物結(jié)合區(qū)域(包括大口袋或者小口袋)；②輔酶PLP結(jié)合部位；③129～145的“環(huán)”結(jié)構(gòu)[6]。Codexis公司利用多輪改造后的ω-轉(zhuǎn)氨酶，成功實(shí)現(xiàn)了R型選擇性的不對(duì)稱轉(zhuǎn)氨過程，實(shí)現(xiàn)了西他列汀的一步不對(duì)稱合成。

2.2.2 改造ω-轉(zhuǎn)氨酶提高其對(duì)大型底物的催化活性

ω-轉(zhuǎn)氨酶本身結(jié)構(gòu)特征使天然的ω-轉(zhuǎn)氨酶很難催化大底物進(jìn)行反應(yīng)，一般認(rèn)為主要是由于活性口袋空間位阻影響大底物進(jìn)入活性中心導(dǎo)致。但是，隨著近年來通過理性設(shè)計(jì)突變加強(qiáng)ω-轉(zhuǎn)氨酶對(duì)大底物活性研究的時(shí)有報(bào)道，如Pavlidis等[14]研究指出：位阻并不是影響大底物反應(yīng)進(jìn)行的唯一因素，反應(yīng)物在特定位點(diǎn)綁定并相互作用是提高催化效率的一個(gè)關(guān)鍵因素；他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，改變?chǔ)?轉(zhuǎn)氨酶的選擇性可能需要重新構(gòu)建酶的整個(gè)底物口袋。同樣是上述例子的ATA117，Savile等[13]利用蛋白質(zhì)工程改造后，使得野生型的底物結(jié)合口袋體積充分?jǐn)U大，使突變體酶能夠接受西他列汀前體酮作為底物；而野生型的ATA117由于底物結(jié)合口袋的限制，不能結(jié)合西他列汀前體酮。在改造中所涉及的突變主要集中在：①酶底物結(jié)合大口袋(S223P顯著增加了大口袋結(jié)合比苯環(huán)大的基團(tuán)的能力)；②底物結(jié)合小口袋(V69G、F112I和A284G使小口袋能夠接受比甲基大的基團(tuán))；③129～145的“環(huán)”結(jié)構(gòu)(“環(huán)”結(jié)構(gòu)上的突變降低了“環(huán)”旋轉(zhuǎn)時(shí)造成的空間位阻)[6]。利用多輪改造后的ω-轉(zhuǎn)氨酶，Codexis公司成功實(shí)現(xiàn)了R型選擇性的轉(zhuǎn)氨過程，并解決了工業(yè)生產(chǎn)反應(yīng)中高濃度的有機(jī)溶劑、高濃度氨基供體(異丙胺)以及產(chǎn)品積累的問題。同時(shí)，值得注意的是，在擴(kuò)大口袋和提高活性的改造過程中，轉(zhuǎn)氨酶ATA117的高選擇性卻沒有降低。

現(xiàn)將(S)-選擇性和(R)-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶及其催化合成手性胺的研究進(jìn)行總結(jié)，具體見表 1～2。

表1 已知的(S)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶及其催化合成的手性胺種類

2.3 ω-轉(zhuǎn)氨酶高通量篩選策略的構(gòu)建

ω-轉(zhuǎn)氨酶的改造過程中需要一種的穩(wěn)定、靈敏和高通量的篩選方法，現(xiàn)在主要通過高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，或建立一種酶活檢測(cè)來篩選[24]。由于ω-轉(zhuǎn)氨酶的不斷發(fā)現(xiàn)及其在合成高價(jià)值化合物中的應(yīng)用發(fā)展迅速，近幾十年來對(duì)ω-轉(zhuǎn)氨酶高通量篩選方法的發(fā)展也隨之加快?；谕ㄓ玫孜锏母咄繖z測(cè)方法是首選方案[25]，因?yàn)樗梢愿斓禺a(chǎn)生結(jié)果，并且可以快速開始檢測(cè)[26]。但是，ω-轉(zhuǎn)氨酶的工業(yè)應(yīng)用底物大多為非天然化合物，使得高通量篩選得到的有益突變體不一定會(huì)對(duì)目標(biāo)底物具有較高的活性，所以往往在高通量篩選之后還需要HPLC進(jìn)行復(fù)測(cè)[19]。

表2 已知的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶及其催化合成的手性胺種類

目前的檢測(cè)手段主要包括紫外(UV)、pH、導(dǎo)熱率、顯色及熒光等技術(shù)(圖4～5)[22]。大多數(shù)TA催化的產(chǎn)物或者底物中會(huì)有酮酸或氨基酸，因此，轉(zhuǎn)氨酶早期的篩選方法主要基于毛細(xì)管電泳[27]，通過離子交換液相色譜法或分光光度檢測(cè)器直接檢測(cè)產(chǎn)生的氨基酸。此外，將轉(zhuǎn)氨過程與脫氫酶作用偶聯(lián)，可以在340 nm處對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)輔因子進(jìn)行分光光度監(jiān)測(cè)[28-29]，達(dá)到篩選的目的。多種顯色物質(zhì)已被設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定，例如一種偶聯(lián)酶測(cè)定法，該測(cè)定法允許使用丙酮酸作為胺受體篩選酶和胺底物，主要的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)通過L-或D-氨基酸氧化酶和辣根過氧化物酶偶聯(lián)，所得的H2O2與連苯三酚紅組合檢測(cè)[22]。Weiss等[30]基于類似的轉(zhuǎn)氨酶/氨基酸氧化酶原理，建立了使用乙醛酸鹽作為胺受體的基于甘氨酸-氧化酶的測(cè)定法，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于(R)-和(S)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的篩選。

圖4 基于UV、pH和電導(dǎo)率檢測(cè)ω-轉(zhuǎn)氨酶酶活的高通量篩選方法Fig.4 High-throughput screening methods employing UV (a,b),pH (c) and conductometric analysis (d) for ω-transaminase activity detection

圖5 比色法和熒光法進(jìn)行高通量篩選Fig.5 High-throughput screening methods employing colorimetric and fluorometric analysis

四唑鹽偶聯(lián)顯色法是另一種常用的檢測(cè)手段。當(dāng)四唑紅被還原時(shí)，α-羥基酮被氧化為二元酮或醛酮，形成紅色沉淀，使用微孔板進(jìn)行讀數(shù)檢測(cè)。這種方法靈敏度高并且背景干擾度低，可用于ω-轉(zhuǎn)氨酶對(duì)一些氨基醇胺類底物改造過程時(shí)的快速檢測(cè)。但是，這種方法無(wú)法用于檢測(cè)ω-轉(zhuǎn)氨酶的對(duì)映體選擇性[31]。通過ω-轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)過程中pH的變化進(jìn)行顯色反應(yīng)則是另一種檢測(cè)手段，一般利用甲基紅作為指示劑[32]。但是這種方法靈敏度低，對(duì)于低活性的ω-轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)比較困難。類似地，有許多利用顯色反應(yīng)來快速檢測(cè)ω-轉(zhuǎn)氨酶活性的方法，如使用CuSO4/甲醇與生成的α-氨基酸生成藍(lán)色絡(luò)合物[33]，采用紫外分光光度測(cè)定法測(cè)定絡(luò)合物在595 nm處的吸光度，用以檢測(cè)ω-轉(zhuǎn)氨酶的活性[25]。

Scheidt等[34]報(bào)道了一種新的ω-轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的方法。該方法使用ω-轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)胺基后形成6-甲氧基萘-2-羰基熒光素，它能產(chǎn)生藍(lán)色熒光。這種方法允許對(duì)底物部分基團(tuán)進(jìn)行替換，有助于在ω-轉(zhuǎn)氨酶蛋白改造過程中對(duì)小口袋和大口袋的大小進(jìn)行初步的檢測(cè)。根據(jù)酮類化合物的熒光光譜，在330(λmax=310 nm)和460 nm(λmax=450 nm) 的熒光強(qiáng)度下，酮化合物濃度≥ 6 μmol/L的條件下，熒光強(qiáng)度與酮濃度之間成線性關(guān)系。該方法特點(diǎn)是反應(yīng)物用量少而且具有很高的靈敏度，方法簡(jiǎn)單和底物消耗量低，非常適合用于對(duì)酶進(jìn)行定向進(jìn)化中的活性檢測(cè)，特別是在ω-轉(zhuǎn)氨酶的L口袋及S口袋容納不同基團(tuán)的研究過程中。

3 級(jí)聯(lián)反應(yīng)提高手性胺產(chǎn)量

鑒于ω-轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)，為了使反應(yīng)充分向手性胺合成的方向進(jìn)行，通常有兩種方法，達(dá)到此目的。一種方法是在單一酶催化系統(tǒng)中使用過量的氨基供體(如,異丙胺)來驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，推動(dòng)反應(yīng)盡可能朝一個(gè)方向進(jìn)行[1]。這種方法只需要單一的ω-轉(zhuǎn)氨酶，在不對(duì)稱手性胺合成中最簡(jiǎn)單且應(yīng)用最廣。但這種方法的缺點(diǎn)是產(chǎn)生的物質(zhì)即為逆反應(yīng)的底物從而抑制正向反應(yīng)進(jìn)行，因此需要加入大量胺基供體催化反應(yīng)向胺生產(chǎn)的方向進(jìn)行。這種方法往往需要聯(lián)合物理方法(如,降低壓力、提高溫度等)移除副產(chǎn)物[35-36]。

第二種方法是進(jìn)行多酶偶聯(lián)催化反應(yīng)，ω-轉(zhuǎn)氨酶的偶聯(lián)催化反應(yīng)一般用于消除底物抑制或者進(jìn)行多級(jí)反應(yīng)[22,37]。ω-轉(zhuǎn)氨酶催化轉(zhuǎn)胺反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物會(huì)抑制反應(yīng)的正向進(jìn)行。所以，在轉(zhuǎn)胺反應(yīng)中，如何去除胺基供體的副產(chǎn)物非常重要[38]。所以在非對(duì)稱合成大型手性胺中，往往會(huì)根據(jù)所使用的胺基供體選擇性移除副產(chǎn)物[39-41]。例如，利用乳酸脫氫酶將抑制劑丙酮酸從反應(yīng)中移除，將反應(yīng)平衡向正方向推動(dòng)[37]，實(shí)現(xiàn)胺供體再循環(huán)；或者，加入普通催化量的胺基供體，使用氨基酸脫氫酶催化NH3再生成胺基供體，推動(dòng)反應(yīng)向正方向進(jìn)行[12]。

Kroutil等[39]和Simon等[40]用氨基酸脫氫酶將丙酮酸再生為丙氨酸，丙氨酸可以再次用作胺基供體，因此反應(yīng)體系中只需加入少量的丙氨酸，可降低副產(chǎn)物丙酮酸的影響。另外，為了保持氨基酸脫氫酶的活性，同時(shí)使用葡萄糖脫氫酶再生氨基酸脫氫酶的輔酶NADH，使反應(yīng)持續(xù)向正方向進(jìn)行，提高手性胺產(chǎn)量(圖6)[23]。

圖6 轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)氨基酸脫氫酶的反應(yīng)方程式Fig.6 The cascade reaction coupling transaminase and amino acid dehydrogenase

Truppo等[37]開發(fā)了一種通過將ω-轉(zhuǎn)氨酶與氨基酸氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)解除反應(yīng)抑制提高ω-轉(zhuǎn)氨酶催化合成手性胺的方法，可用于篩選立體選擇性優(yōu)良的ω-轉(zhuǎn)氨酶。該方法將胺基底物和丙酮酸在ω-轉(zhuǎn)氨酶的催化下進(jìn)行反應(yīng)，通過添加氨基酸氧化酶利用氧分子將丙酮酸轉(zhuǎn)化為D-丙氨酸或L-丙氨酸，消除產(chǎn)物抑制，促進(jìn)正向反應(yīng)的進(jìn)行。丙氨酸被氨基酸還原酶催化與O2發(fā)生不可逆反應(yīng)生成H2O2，H2O2的產(chǎn)生可以通過添加焦糖紅和辣根過氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)[22](圖7)。

圖7 轉(zhuǎn)氨酶偶聯(lián)氨基酸氧化的反應(yīng)方程式Fig.7 The cascade reaction coupling transaminase and amino acid oxidase

France等[42]使用羧酸還原酶(CAR)，亞胺還原酶(IRED)結(jié)合ω-轉(zhuǎn)氨酶的一鍋法催化合成單取代和雙取代的哌啶和吡咯烷，獲得光學(xué)純手性單取代-雙取代的哌啶和吡咯烷(圖8)。使用生物級(jí)聯(lián)催化，反應(yīng)從酮酸或酮醛開始，取代生成哌啶或吡咯烷骨架。在保持高催化效率的同時(shí)表現(xiàn)出高區(qū)域選擇性及立體選擇性。他們還系統(tǒng)研究了影響一個(gè)甲基環(huán)上取代基的位置被IRED催化減少手性亞胺，在反應(yīng)過程中觀察到反應(yīng)過程中各種底物與不同酶之間會(huì)形成一種平衡，反應(yīng)中使用來自Mycobacteriummarinum的羧酸還原酶可選擇性地將羧酸轉(zhuǎn)化為醛類，再使用ω-轉(zhuǎn)氨酶ATA113或ATA117選擇性合成不同構(gòu)型的手性中心，最后使用(R)- 或(S)-IRED合成雙手性中心的哌啶和吡咯烷。這種方法成功地實(shí)現(xiàn)了使用多酶偶聯(lián)控制催化合成雙手性中心的哌啶和吡咯烷[43](圖9)。

圖8 生物法合成2,x-二取代基吡啶(n=0)或吡咯(n=1)路線Fig.8 The biosynthesis route of 2,x-pyridine (n=0)or pyrrole (n=1)

圖9 生物法合成2,6-二取代基吡啶或2,5-二取代基吡咯的路線Fig.9 The biosynthesis route of 2,6-pyridine or 2,5-pyrrole

4 ω-轉(zhuǎn)氨酶不對(duì)稱合成手性胺及非天然氨基酸

由于制藥、化妝品、食品、化學(xué)和農(nóng)業(yè)等不同行業(yè)的需求，非天然氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)日漸重要。通常，采用直接提取或者發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸，但是，對(duì)于非天然氨基酸，使用發(fā)酵法生產(chǎn)目前尚未見工業(yè)化的例子。目前，ω-TA已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于不對(duì)稱合成生產(chǎn)α-和β-非天然氨基酸，這種通過酶催化方法在合成光學(xué)純手性胺方面顯示出了一定的潛力。

4.1 ω-轉(zhuǎn)氨酶制備α-非天然氨基酸

以制備L-高丙氨酸為例，光學(xué)純L-高丙氨酸可由ω-TA將2-氧代丁酸和芐胺不對(duì)稱催化合成[44]。然而，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的苯甲醛會(huì)造成嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率急劇降低。為減輕對(duì)苯甲醛的產(chǎn)物抑制，引入了己烷作為反應(yīng)溶劑的雙相反應(yīng)體系。雙相體系能夠很大幅度地減少產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，使產(chǎn)率從39%增加到96%，e.e.>99%。L-高丙氨酸也可以通過從L-蘇氨酸進(jìn)行生產(chǎn)，反應(yīng)主要通過蘇氨酸脫氨酶(TD)和ω-TA組成酶偶聯(lián)反應(yīng)。在此反應(yīng)中，TD將L-蘇氨酸脫氨成2-氧代丁酸，再通過ω-TA不對(duì)稱轉(zhuǎn)化成L-高丙氨酸。該體系的主要優(yōu)點(diǎn)在于避免了以α-酮酸作為反應(yīng)物，從而可以促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行[46]。Bea等[46]通過D-氨基酸氧化酶(D-AAO)和ω-TA聯(lián)合反應(yīng)，使用去醛化方法從外消旋-高丙氨酸生成光學(xué)純的L-高丙氨酸，該方法主要采用雙相反應(yīng)體系，使用全細(xì)胞反應(yīng)將500 mmol/L外消旋-高丙氨酸轉(zhuǎn)化為485 mmol/L 光學(xué)純L-高丙氨酸 (e.e.>99%)，而且該ω-TA也可以用于從3-氟丙酮酸和(S)-α-甲基芐胺不對(duì)稱催化合成(R)-3-氟丙氨酸，轉(zhuǎn)化率為95%，e.e.>99%[47]。

因?yàn)棣?TA催化的反應(yīng)平衡常數(shù)較低，光學(xué)純的(S)-和(R)-氨基酸可以使用偶聯(lián)(α/ω)-TA反應(yīng)進(jìn)行合成，以提高光學(xué)純氨基酸和手性胺的收率。如，(S)-苯丙氨酸、(S)-高苯丙氨酸和(S)-天冬氨酸等(S)-型氨基酸的生產(chǎn)主要通過AlaTA/ω-TA、TyrTA/ω-TA進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)[48]。然而，由于ω-TA反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物酮在高濃度下會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致產(chǎn)率過低。因此，與生產(chǎn)L-高丙氨酸類似，可引入雙相反應(yīng)體系克服產(chǎn)物抑制，提高產(chǎn)物收率。通過分析有機(jī)溶劑分配系數(shù)，及其對(duì)酶活影響和生物相容性，最終選擇鄰苯二甲酸二辛酯-水作為雙相反應(yīng)體系，最終，不對(duì)稱合成(S)-苯丙氨酸和L-高丙氨酸，的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到93%和95%[50]。同時(shí)，該反應(yīng)體系被應(yīng)用于(R)-α-甲基芐胺的生產(chǎn)，轉(zhuǎn)化率分別為56%(e.e.>95%)和54%(e.e.>96%)。另外，脂肪族的(S)-氨基酸，如(S)-纈氨酸和(R)-亮氨酸也可用同樣的體系生產(chǎn)[48]。

4.2 ω-轉(zhuǎn)氨酶制備β-非天然氨基酸

β-氨基酸主要用于制備抗生素，酶抑制劑等具有藥理學(xué)性質(zhì)的化合物。如，具有抗真菌和抗腫瘤活性的順戊霉素和紫杉醇就是通過β-氨基酸合成的[49]。目前，ω-TA已成功用于生成脂肪族和芳香族β-氨基酸。例如光學(xué)純的脂肪族β-氨基酸(D-β-氨基-正丁酸)可以通過偶聯(lián)來自Mesorhizobiumsp.的β-TA與脂肪酶，針對(duì)酮羧酸酯底物不對(duì)稱合成光學(xué)純的芳族β-氨基酸，收率>20%，e.e.> 99%。盡管這種酶被命名為β-TA并且強(qiáng)調(diào)其對(duì)β-氨基酸的活性，但是該酶通?？梢员环Q為ω-TA。在之后的研究中，該酶的蛋白質(zhì)序列被鑒定為ω-TA類蛋白序列[50]。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著手性藥物的發(fā)展，手性胺類化合物作為藥物中間體變得越來越廣泛。ω-轉(zhuǎn)氨酶作為一種重要的工業(yè)用酶，主要用于不對(duì)稱合成手性胺類藥物中間體，其催化的反應(yīng)作為合成手性胺類藥物在提高產(chǎn)品光學(xué)純度、保護(hù)環(huán)境等方面有著非常重要的意義，相關(guān)研究變得越來越重要。但是目前能夠應(yīng)用于工業(yè)應(yīng)用的ω-轉(zhuǎn)氨酶較少，其原因主要是：1)大部分ω-轉(zhuǎn)氨酶序列相似度較低，使ω-轉(zhuǎn)氨酶的研究還需要大量實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證；2)天然ω-轉(zhuǎn)氨酶本身活性口袋較小，使得相當(dāng)一部分ω-轉(zhuǎn)氨酶不能滿足實(shí)際應(yīng)用；3)絕大多數(shù)天然ω-轉(zhuǎn)氨酶是S-選擇性，自然界缺乏R-選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶。

因此，挖掘新的ω-轉(zhuǎn)氨酶基因、改造現(xiàn)有的ω-轉(zhuǎn)氨酶以及探究ω-轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)特點(diǎn)變得尤其重要。今后ω-轉(zhuǎn)氨酶的研究主要會(huì)集中在ω-轉(zhuǎn)氨酶新酶的篩選和改造、級(jí)聯(lián)反應(yīng)提高手性胺的產(chǎn)率上，最終實(shí)現(xiàn)ω-轉(zhuǎn)氨酶對(duì)不同大小、不同構(gòu)型手性胺的不對(duì)稱合成。

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