齒毛菌漆酶對活性亮藍(lán)的高效脫色

江 聰,尹大強(qiáng),許鑫琦,林 娟,葉秀云,楊 捷*

(1.福州大學(xué)福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗室,福建 福州 350116;2.同濟(jì)大學(xué)長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,上海 200092)

染料廣泛應(yīng)用于印染、化妝品、食品等行業(yè),據(jù)統(tǒng)計已用于商業(yè)的染料種類超過105種,根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為偶氮類、蒽醌類、靛類、三苯甲烷類和雜環(huán)類等[1].目前,我國每年生產(chǎn)的染料高達(dá)上百萬噸,其中10%～20%的染料會直接隨廢水排入環(huán)境中.染料廢水具有降解難、色度高、染料結(jié)構(gòu)差異大、毒性高等特點(diǎn),不僅污染環(huán)境,而且可能對人和其他生物造成致毒、致癌、致突變的嚴(yán)重影響[2].目前染料廢水處理技術(shù)主要有物理法、化學(xué)法、生物法等.物理法和化學(xué)法的效率低、能耗大、成本高且容易形成毒性更強(qiáng)的副產(chǎn)物;與之相比,生物法因具有成本低、效率高且能避免二次污染的優(yōu)點(diǎn),被越來越多地應(yīng)用于染料廢水的處理[3].

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,廣泛分布于高等植物和真菌中,因其催化反應(yīng)只需要氧氣且最終副產(chǎn)物只有水,被認(rèn)為是綠色催化劑.漆酶有較廣泛的底物催化范圍,在紡織、造紙、制藥、化妝品、生物修復(fù)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,其中在紡織和造紙業(yè)中被應(yīng)用于染料廢水的脫色.漆酶的來源是影響其脫色率最重要的因素,例如:Osma等[4]采用絨毛栓菌(Trametespubescens)漆酶對活性亮藍(lán)(Remazol Brilliant Blue R,RBBR)染料脫色42 h,脫色率為44%;而Lu等[5]采用血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶對RBBR脫色2 h,脫色率即可達(dá)94%.此外,介體和酶的固定化也影響漆酶的脫色效果,小分子介體可以拓寬漆酶的氧化底物范圍,提高脫色率，但在染料脫色處理中存在脫色時間長、脫色率不高的問題，若添加介體會使成本升高,且容易使漆酶失活,還可能具有毒性[6],在一定程度上制約了漆酶的實(shí)際應(yīng)用.因此,篩選高效降解染料的菌種顯得尤為重要.

RBBR是一種蒽醌類染料,由于其著色效果好、色牢度高且可作為前體物質(zhì)合成許多染料,在紡織和印染工業(yè)中應(yīng)用廣泛,但因其有毒且難降解,被認(rèn)為是有機(jī)污染物的代表[7].本實(shí)驗室前期通過選育得到一株齒毛菌(Cerrenaunicolor)菌株HYB07,其具有漆酶產(chǎn)量高、底物范圍廣、催化活力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),最適pH為3.0,常溫下反應(yīng)能保持較高酶活力[8].本研究利用HYB07菌株制備的漆酶對RBBR進(jìn)行脫色,以RBBR染料脫色率為響應(yīng)值,在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化脫色條件[9],并通過紅外光譜和薄層色譜分析驗證RBBR的降解效果,以期為漆酶在染料脫色中的應(yīng)用提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 主要材料

齒毛菌HYB07菌株由福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗室篩選保存.馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基按照《微生物學(xué)實(shí)驗》中的方法[10]配制.種子培養(yǎng)基配方與PDA固體培養(yǎng)基相同,但不添加瓊脂.液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1 L):糊精60 g，蛋白胨15 g，酒石酸銨2 g，KH2PO46.0 g，MgSO4·7H2O 4.2 g，CaCl20.3 g，NaCl 0.2 g，CuSO4·5H2O 62.5 mg，ZnSO4·7H2O 18.0 mg，維生素B115.0 mg.

RBBR和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)購于美國Sigma公司,乙腈(色譜純)、無水乙酸鈉、冰乙酸、糊精、蛋白胨、瓊脂等(均為分析純)試劑購買于國藥化學(xué)試劑有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 漆酶的制備

取斜面保藏的齒毛菌HYB07菌株接種于PDA平板,30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d.菌株活化后,接種于液體種子培養(yǎng)基,30 ℃恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)2 d,制成一級種子液;然后將一級種子液以6%(體積分?jǐn)?shù),下同)的接種量接入二級種子培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)2 d;再將二級種子液以6%的接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫?fù)u瓶發(fā)酵6 d.12 000 r/min室溫離心分離菌絲體和發(fā)酵液,上清液即為粗酶液,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 漆酶活力及蛋白質(zhì)含量測定

漆酶活力測定[5]以ABTS為底物,反應(yīng)體系2.0 mL,其中含0.975 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 3.0)、1.0 mL 0.5 mol/L ABTS溶液和25 μL粗酶液.30 ℃恒溫水浴反應(yīng),測定前5 min內(nèi)ABTS在420 nm(ε420=36 000 L/(mol·cm))處吸光度的增加值.以熱滅活10 min的粗酶液作為空白對照.每分鐘催化氧化1 μmol ABTS所需的酶量定義為1個酶活力單位(U).蛋白含量測定采用Bradford法,并繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線[8],測得漆酶比活力為629.8 U/mg.實(shí)驗均設(shè)置3組平行樣品,并進(jìn)行均方差分析.

1.2.3 染料脫色率的測定

采用全波長酶標(biāo)儀(Multiskan GO,Thermo Scientific公司)在波長200～1 000 nm范圍內(nèi)對RBBR溶液進(jìn)行全波長掃描,確定最大吸收波長為574 nm,并測定脫色前后574 nm處的吸光度A0和A1,計算脫色率R(%):R=(1-A1/A0)×100%.

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化漆酶對RBBR脫色的條件

利用單因素試驗分別對pH(3.0～7.0)、酶濃度(0.1～5 U/mL)、染料質(zhì)量濃度(50～800 mg/L)、脫色時間(10～60 min)進(jìn)行優(yōu)化.緩沖液采用甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 3.0)和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.0～7.0).基于單因素試驗優(yōu)化的結(jié)果,采用Design Expert v8.0.6軟件的中心組合設(shè)計(central composite design,CCD)建立4因素3水平的響應(yīng)面法分析模型,確定漆酶對RBBR脫色的最佳條件.以脫色率為響應(yīng)值,酶濃度、染料質(zhì)量濃度、pH和脫色時間為自變量,每個自變量均選擇3個水平:酶濃度選擇0.8,1.5,2.2 U/mL;染料質(zhì)量濃度選擇100,150,200 mg/L;pH選擇4.0,5.0,6.0;脫色時間選擇20,30,40 min.

1.2.5 漆酶對RBBR反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)測定

配制不同質(zhì)量濃度(20～2 000 mg/L)的RBBR染料,以pH 4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液,酶濃度為1 U/mL,脫色10 min后測定脫色率;利用GraphPad Prism v5.0軟件進(jìn)行非線性回歸分析,計算漆酶反應(yīng)的米氏常數(shù)Km和最大速率Vm.實(shí)驗進(jìn)行3次重復(fù).

1.2.6 紅外光譜分析

將在最佳條件下脫色的RBBR混合液樣品和加入滅活漆酶處理的RBBR樣品進(jìn)行冷凍干燥,取2 mg冷凍干燥后的固體,加入200 mg KBr，混勻,在瑪瑙研缽中研磨、壓片;用傅里葉紅外光譜儀(360智能型,美國尼高麗儀器有限公司)先對純KBr薄片進(jìn)行背景掃描,再對樣品的薄片進(jìn)行掃描,得到紅外光譜圖;比較紅外光譜圖，分析RBBR經(jīng)漆酶催化脫色后的化學(xué)鍵斷裂情況.

1.2.7 薄層色譜分析

在硅膠薄層層析點(diǎn)樣板上,將在最佳條件下脫色的RBBR混合液樣品和加入滅活漆酶處理的RBBR樣品進(jìn)行上樣;在擴(kuò)展槽內(nèi)加入適量展樣劑,放入硅膠點(diǎn)樣板,加蓋密封展樣,展樣劑為V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=3∶1∶1;當(dāng)樣品完全展開后,取出晾干,放入裝有碘晶體的密閉容器中顯影,以判斷RBBR脫色處理后是否產(chǎn)生了新物質(zhì).

2 結(jié)果與討論

2.1 基于響應(yīng)面法的脫色條件優(yōu)化

通過單因素優(yōu)化試驗(圖1),得到齒毛菌HYB07菌株所產(chǎn)漆酶對RBBR脫色的最佳條件為:pH 5.0,酶濃度3 U/mL,染料質(zhì)量濃度100 mg/L,脫色時間30 min.溫度對酶的催化活性也有較大影響,但前期研究中發(fā)現(xiàn)該漆酶在室溫下可保持較高的催化活性,故本研究中未對溫度進(jìn)行優(yōu)化.

圖1 單因素優(yōu)化試驗Fig.1 Single factor optimization test

在單因素優(yōu)化試驗基礎(chǔ)上,采用Design Expert v8.0.6軟件用-1,0,1對酶濃度(X1)、染料質(zhì)量濃度(X2)、pH(X3)和脫色時間(X4)這4個因素編碼,脫色率(Y)為響應(yīng)值.通過CCD對4個因素進(jìn)行優(yōu)化,再對試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到脫色率的回歸模型方程為:

Y=86.10+12.90X1-2.54X2-13.49X3+

7.40X4+0.63X1X2+0.83X1X3+

1.46X1X4+3.81X2X3+1.16X2X4+

1.26X3X4-6.34X12-2.63X22-

14.13X32-4.66X32.

回歸模型方程的方差分析結(jié)果見表1.回歸模型的F值為41.04,p<0.000 1,表明所得模型差異極顯著;模型誤差失擬p=0.143 8>0.05,說明該模型失擬不顯著,即該二次方程能夠較好地擬合真實(shí)水平,可靠性較高;模型的一次項中X1、X3、X4差異極顯著,X2X3交互項差異顯著,二次項中X12、X32、X42差異極顯著,X22差異顯著.模型的決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為95.81%和92.04%,說明該模型精確性較高.因此,該模型可用于RBBR脫色率的預(yù)測.

各因素的F值可以用來評價該因素對試驗指標(biāo)影響的顯著程度，F(xiàn)值越大表示該因素的影響越顯著.如表1所示,F(X1)=140.82,F(X2)=5.48,F(X3)=154.16,F(X4)=46.35,由此綜合分析可知,在所選取的因素水平范圍內(nèi),各因素對脫色率的影響由大到小依次為:pH>酶濃度>脫色時間>染料質(zhì)量濃度.

根據(jù)二次回歸方程繪制響應(yīng)面圖和等高線圖,可得到最佳參數(shù)及各參數(shù)間的相互作用.響應(yīng)面曲線可用于解釋變量間的交互作用并確定達(dá)到最高脫色率時每個變量的最優(yōu)水平.響應(yīng)面曲面的坡度可反映該因素對RBBR脫色率影響的強(qiáng)弱程度.每個響應(yīng)面表示當(dāng)其中1個變量處于最佳水平時,另外2個獨(dú)立變量之間的相互作用.等高線圖中同一橢圓曲線上染料的脫色率是相同的,染料脫色率在橢圓形的中心值最高,并由中心向邊緣逐漸降低.同時等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示2個因素交互作用明顯,圓形表示交互作用不明顯.本研究選定4個主要因素,優(yōu)化可以得到4個因素兩兩之間交互的6個響應(yīng)面圖(圖2)和相應(yīng)的等高線圖(圖3).

表1 回歸模型方程的方差分析

注：*p<0.05,差異顯著;**p<0.001,差異極顯著.

圖3 不同因素交互作用對RBBR脫色率影響的等高線圖Fig.3 Contour line plots of the interactive effect of different factors on RBBR decolorization

圖2(a)和(b)所示的兩因素交互作用最小,在選定的pH和染料質(zhì)量濃度范圍內(nèi),RBBR脫色率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,存在極大值;而RBBR脫色率隨酶濃度的增加而增大.同時由對應(yīng)的等高線圖(圖3(a)和(b))可見,pH對應(yīng)的等高線變化趨勢較染料質(zhì)量濃度的陡峭,因此推測pH對RBBR脫色率的影響比染料質(zhì)量濃度大.圖3(a)顯示酶濃度與染料質(zhì)量濃度的等高線近似于圓形,表明酶濃度與染料質(zhì)量濃度的交互效應(yīng)不明顯;而由圖3(d)可以看出,染料質(zhì)量濃度與pH的等高線呈橢圓形,且中心點(diǎn)角度大,表明兩因素的交互效應(yīng)明顯.

2.2 RBBR最佳脫色條件及檢驗

分析得到最大響應(yīng)值時,X1～X4對應(yīng)的編碼值分別為1.055,0.523,-0.480,0.830,與其相對應(yīng)的理論預(yù)測最佳脫色條件為:酶濃度2.24 U/mL,染料質(zhì)量濃度123.83 mg/L,pH 4.52,脫色時間38.30 min,預(yù)測最佳脫色率可達(dá)99.82%.為檢驗響應(yīng)面法的可靠性,采用上述最佳脫色條件進(jìn)行實(shí)驗,并考慮到實(shí)際操作條件的簡化,將最佳脫色條件修正為:酶濃度2.2 U/mL,染料質(zhì)量濃度124 mg/L,pH 4.5,脫色時間38 min.在此條件下進(jìn)行3次實(shí)驗,得到脫色率為(98.42±1.39)%,與理論預(yù)測值差異不顯著,說明用響應(yīng)面法優(yōu)化漆酶對RBBR脫色的條件具有可行性.

目前在國內(nèi)外報道的漆酶對RBBR脫色降解的研究中,降解體系大致分為酶、酶-介體(laccase-mediator system,LMS)和固定化酶3種.在LMS的處理中,Sathishkumar等[11]應(yīng)用Pleulrotusflorida漆酶對RBBR脫色,添加介體1-羥基苯并三唑(HBT)處理的脫色率是純酶處理的1.56倍;類似地,Soares等[12]研究表明,商業(yè)漆酶CLF只有添加介體才能對RBBR脫色.在不添加介體的報道中,Mechichi等[13]研究顯示添加0.1 mmol/L HBT并不能提高毛栓菌(T.trogii)漆酶對RBBR的脫色率;Khlifi等[14]認(rèn)為變色栓菌(T.versicolor)漆酶可以單獨(dú)對RBBR進(jìn)行脫色而不需要介體.在固定化酶處理中,Kunamneni等[15]采用嗜熱絲孢桿菌(Myceliophthomthermo-phila)漆酶,在固定化和添加HBT的情況下,對RBBR脫色24 h的脫色率為31%.表2總結(jié)了目前已報道的不同菌種所產(chǎn)漆酶對RBBR的降解特性,綜合比較表中數(shù)據(jù)可知:雖然介體的添加和酶的固定化處理對脫色時間和脫色率有一定影響,但菌種來源是影響漆酶對染料脫色的最重要因素,因此篩選一株高效脫色的產(chǎn)漆酶菌種尤為重要.本研究采用的齒毛菌HYB07菌株所產(chǎn)漆酶對RBBR的脫色時間為38 min,脫色率達(dá)(98.42±1.39)%,比目前已有報道的漆酶脫色效果更佳.

表2 不同菌種所產(chǎn)漆酶對RBBR的降解特性

注：*酶活測定底物為2,6-二甲氧基酚,此外其他酶活測定底物均為ABTS.VA為紫脲酸,ACE為乙酰丁香酮.

2.3 漆酶對RBBR脫色反應(yīng)的動力學(xué)分析

如圖4所示,在RBBR質(zhì)量濃度0～200 mg/L范圍內(nèi),脫色反應(yīng)速率呈線性上升,隨著RBBR質(zhì)量濃度的增加,反應(yīng)速率增加逐漸趨于平緩.這種變化趨勢符合米氏方程描述的反應(yīng)速率隨底物濃度的變化規(guī)律.

圖4 漆酶對RBBR脫色的反應(yīng)動力學(xué)Fig.4 The kinetics of RBBR decolorization reaction by laccase

通過GraphPad Prism v5.0軟件求得漆酶對RBBR脫色反應(yīng)的Km值為(134.82±3.05) mg/L,Vm值為(9.68±0.85) mg/(L·min);反應(yīng)動力學(xué)方程為Y=9.68X/(134.82+X),其中X為RBBR質(zhì)量濃度,Y為反應(yīng)速率.Km是酶催化反應(yīng)的特征常數(shù)之一,反映酶對底物親和力的大小.P.florida漆酶對RBBR脫色反應(yīng)的Km值為145.82 mg/L[7],高于本研究的結(jié)果,但需要添加介體才能達(dá)到較高的脫色率,而本研究采用的齒毛菌漆酶不需要添加介體也能達(dá)到98%以上的脫色率,進(jìn)一步證明了該漆酶運(yùn)用于RBBR染料脫色的實(shí)際價值.

2.4 RBBR降解產(chǎn)物分析

圖5為RBBR染料脫色前后的紫外-可見光譜譜圖.由圖可見,脫色前RBBR在可見光區(qū)595 nm處有一個明顯的特征吸收峰，而在加入漆酶脫色處理后此處的吸收峰消失,證明染料RBBR發(fā)生了降解.類似地,戴文魁[22]曾報道的雜色云芝菌(CoriolusversicolorLZ-8)漆酶降解RBBR的實(shí)驗結(jié)果顯示,在脫色處理后400～700 nm范圍內(nèi)的特征吸收峰消失.

圖5 RBBR脫色前后的紫外-可見光譜Fig.5 UV-visible spectra of RBBR before and after decolorization

利用紅外光譜分析波數(shù)4 000～500 cm-1范圍內(nèi)RBBR脫色前后的產(chǎn)物,由譜圖可見脫色后955.35和1 266.78 cm-1處的吸收峰消失(圖6).該峰是C—N的伸縮振動峰,說明RBBR經(jīng)漆酶處理后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,C—N鍵斷裂造成發(fā)色基團(tuán)被破壞,使RBBR從藍(lán)色變成無色.Osma等[4]采用絨毛栓菌漆酶對RBBR處理后也發(fā)現(xiàn)C—N鍵斷裂,發(fā)色基團(tuán)被破壞,并形成兩個副產(chǎn)物,與本研究結(jié)果一致.

圖6 漆酶對RBBR脫色前后的紅外光譜Fig.6 The infrared spectra of RBBR before and after decolorization with laccase

通過薄層色譜進(jìn)一步驗證RBBR經(jīng)漆酶處理后的結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果顯示脫色后產(chǎn)生一個新的條帶(圖7),證明其結(jié)構(gòu)確實(shí)發(fā)生了改變.

圖7 漆酶對RBBR脫色前后的薄層色譜圖Fig.7 The thin layer chromatography of RBBR before and after decolorization with laccase

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法建立了齒毛菌漆酶對RBBR脫色條件的二次項數(shù)學(xué)模型,得出影響脫色效果的因素主次順序為pH>酶濃度>脫色時間>染料質(zhì)量濃度,并得到最佳脫色條件為:酶濃度2.24 U/mL,RBBR染料質(zhì)量濃度123.83 mg/L,pH 4.52,脫色時間38.30 min.在此條件下,進(jìn)行3次驗證實(shí)驗,測得脫色率為(98.42±1.39)%.通過紅外光譜和薄層色譜分析,發(fā)現(xiàn)RBBR經(jīng)齒毛菌漆酶處理后C—N鍵發(fā)生斷裂,RBBR結(jié)構(gòu)發(fā)生變化.以RBBR為底物,齒毛菌漆酶催化脫色反應(yīng)的Km值為(134.82 ±3.05) mg/L.本研究采用的白腐真菌齒毛菌漆酶在未添加介體的情況下,脫色效果明顯高于已有文獻(xiàn)報道的結(jié)果,在染料降解方面具有較大的應(yīng)用潛力.

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