低溫季節(jié)不同種群擬穴青蟹線粒體呼吸速率和酶活性的差異

劉子明,王桂忠,李少菁,陳志剛

(廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院,近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361102)

青蟹隸屬于甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)梭子蟹科(Portunidae)青蟹屬(Scylla).一般認(rèn)為青蟹屬有4個(gè)種,主要分布于暖溫帶和熱帶海域．形態(tài)學(xué)以及12SrRNA、16SrRNA和CO1基因序列分析結(jié)果表明,我國沿海的青蟹優(yōu)勢種為擬穴青蟹(Scyllaparamamosain),主要分布于長江口以南的東南沿岸水域,是一種重要的經(jīng)濟(jì)蟹類[1-8]．我國擬穴青蟹養(yǎng)殖規(guī)模較大,相關(guān)的研究也較多[9],但其種群生物學(xué)的研究較少[10]．本課題組曾從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)等方面對擬穴青蟹種群生物學(xué)進(jìn)行了一些研究,結(jié)果表明:分布于我國東南沿海的擬穴青蟹可能已分化為南、北2個(gè)種群,且南、北種群的個(gè)體混雜分布于我國不同海域,隨緯度變化,同一海域不同種群所占的比例不同．北方種群的個(gè)體主要分布于緯度較高的江浙沿岸海域,緯度越低則個(gè)體數(shù)量越少;南方種群的個(gè)體主要分布于緯度較低的海南島和北部灣沿岸海域,緯度越高則個(gè)體數(shù)量越少．南、北2個(gè)種群適應(yīng)環(huán)境溫度的能力不同,北方種群比南方種群更能適應(yīng)低溫環(huán)境,在高溫環(huán)境下則是南方種群比北方種群生長得更好[10-12]．

最近,本課題組分析了分布在我國不同海域的擬穴青蟹的線粒體呼吸速率和代謝酶活性的季節(jié)性變化,發(fā)現(xiàn)分布在北方海域的擬穴青蟹的線粒體呼吸速率和細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)活性明顯高于分布在南方海域的個(gè)體,說明分布于北方海域的擬穴青蟹比分布于南方海域的個(gè)體更能適應(yīng)低溫環(huán)境[12],這一結(jié)果進(jìn)一步支持了分布在我國東南沿海的擬穴青蟹可能已分化為南、北2個(gè)不同種群的觀點(diǎn)．前已述及,擬穴青蟹南、北種群的個(gè)體是混雜分布于我國不同海域的,隨緯度變化，同一海域中不同種群所占的比例不同．為了進(jìn)一步探究在同一海域中是否北方種群比南方種群更能適應(yīng)低溫環(huán)境,本研究在我國東南沿海不同緯度的海域采集低溫季節(jié)的擬穴青蟹野生樣品，比較南、北種群的線粒體呼吸速率以及CCO、乳酸脫氫酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)活性的差異,以期了解分布于我國東南沿海的擬穴青蟹的種群分化情況、不同種群的分布規(guī)律及其生理特征,為我國擬穴青蟹種質(zhì)資源的開發(fā)和保護(hù)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)和管理提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 擬穴青蟹樣品采集與處理

表1 采樣時(shí)采樣點(diǎn)海水的溫度、鹽度及樣品的生物學(xué)參數(shù)

在我國熱帶、亞熱帶海域采集低溫季節(jié)的野生擬穴青蟹,采樣點(diǎn)為浙江省寧波海域(緯度約29°14′ N)、福建省漳州海域(緯度約23°79′ N)和海南省儋州海域(緯度約19°69′ N),采樣時(shí)間為2010年11月、2010年12月和2011年1月．采集到的擬穴青蟹活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,按照本課題組確立的鑒定方法[12]進(jìn)行分類鑒定以篩選出南、北種群的典型個(gè)體：擬穴青蟹南方種群個(gè)體的螯足腕節(jié)外緣有2根刺,其中1根刺極小;北方種群個(gè)體的螯足腕節(jié)外緣只有1根發(fā)達(dá)的刺．選取處于同一發(fā)育階段、肢體完整健康的個(gè)體在實(shí)驗(yàn)室中暫養(yǎng)2 d，以使其恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)．每個(gè)采樣點(diǎn)的每個(gè)種群選取6只個(gè)體用于線粒體呼吸速率的測定和相關(guān)酶活性的分析．每只擬穴青蟹養(yǎng)在一個(gè)120 L的培養(yǎng)箱中,內(nèi)含100 L過濾海水,溫度和鹽度與采樣點(diǎn)海水的一致,培養(yǎng)期間連續(xù)充氣,每天投喂適量的合適餌料．采樣時(shí)采樣點(diǎn)海水的溫度、鹽度以及南、北種群個(gè)體的殼寬和性別比例見表1．

1.2 線粒體提取及其蛋白質(zhì)含量測定

提取線粒體時(shí),將暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室的擬穴青蟹經(jīng)24 h饑餓處理后,剪開其頭胸甲取出鰓、肝胰腺和附肢肌肉,其中2只螯足放于-70 ℃超低溫冰箱中保存以備酶活分析之用．按照Liu等[12]的方法提取鰓、肝胰腺和肌肉的線粒體．采用BCA(bicinchoninic acid)法[13]測定線粒體制備液的蛋白質(zhì)含量．在蛋白質(zhì)含量測定之前,將10 μL的線粒體制備液溶解于1 mL不含牛血清白蛋白(BSA)的提取緩沖液中,在12 000g、4 ℃條件下離心10 min,沉淀之后再經(jīng)2次溶解和離心以去除BSA對總蛋白測定的影響[14]．

1.3 線粒體呼吸速率測定

使用英國Hansatech公司生產(chǎn)的Clark LS2H型氧電極測定線粒體呼吸速率,測定溫度為25 ℃,3種組織的測定方法一致,均采用經(jīng)改良的Hulbert等[15]的方法．首先往反應(yīng)室中加入1.98 mL 呼吸緩沖液(100 mmol/L KCl、40 mmol/L 蔗糖、5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、10 mmol/L K2HPO4、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)BSA,pH=7.2).接著加入50 μL的線粒體制備液,待基線平穩(wěn)后,線粒體耗氧率接近于零,此時(shí)為線粒體的狀態(tài)1呼吸速率.再加入10 μL 琥珀酸(終濃度為2 mmol/L)或丙酮酸+蘋果酸(二者的終濃度均為5 mmol/L),此時(shí)測得的耗氧率為線粒體狀態(tài)2呼吸速率.然后加入10 μL二磷酸腺苷(ADP，終濃度為0.2 mmol/L),此后耗氧率會(huì)顯著上升,為線粒體狀態(tài)3呼吸速率,即線粒體最大耗氧率.此狀態(tài)持續(xù)一段時(shí)間后,耗氧率隨著ADP的消耗而逐漸下降,ADP耗盡后的耗氧率則為線粒體的狀態(tài)4呼吸速率．線粒體呼吸速率的單位[nmol/(min·mg)]表示為每分鐘每毫克線粒體蛋白質(zhì)消耗的納摩爾氧．

1.4 線粒體CCO活性分析

在CCO活性測定前,將肝胰腺、鰓和肌肉的線粒體制備液稀釋于低滲的KCl溶液(10 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris,pH=7.6),經(jīng)凍融破裂線粒體外膜以便能更有效地進(jìn)行測定[16]．CCO活性測定采用美國安捷倫公司生產(chǎn)的Agilent Cary-100型紫外-可見分光光度計(jì)在550 nm波長下測定還原態(tài)細(xì)胞色素C的氧化量,測定溫度為25 ℃,反應(yīng)時(shí)間為4 min,反應(yīng)體系為pH 7.5的100 mmol/L K3PO4和0.05 mmol/L 的還原態(tài)細(xì)胞色素C．CCO活性單位(U)表示為每毫克線粒體蛋白1 min內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)．還原態(tài)細(xì)胞色素C是通過在細(xì)胞色素C中加入過量Na2S2O4還原產(chǎn)生的,還原過程通過加入足量的氣泡以去除多余的Na2S2O4[17]．

1.5 肌肉酶活性分析

從每只蟹的螯足中稱取0.2 g肌肉,加入2 mL緩沖液(10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、10 mmol/L Tris、0.5% BSA,pH=7.5)進(jìn)行勻漿．使用Polytron組織勻漿機(jī)以20%最大速度勻漿2次,每次45 s,每次間隔1 min．勻漿在4 000g、4 ℃條件下離心10 min,取上清液用于酶活性測定．酶活性測定的溫度為25 ℃．采用修改的Thibault等[17]的方法測定LDH活性,其反應(yīng)體系為0.1 mol/L K3PO4、0.32 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、1.6 mmol/L 丙酮酸,pH=7.0．采用修改的Hansen等[18]的方法測定HK和PK活性.HK的反應(yīng)體系為55 mmol/L Tris、10 mmol/L MgCl2、80 mmol/L葡萄糖、24 mmol/L三磷酸腺苷(ATP)、1.6 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、14 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶,pH=7.4；PK的反應(yīng)體系為25 mmol/L咪唑、10 mmol/L MgSO4、100 mmol/L KCl、5 mmol/L ADP、2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、0.3 mmol/L NADH、5.5 U LDH,pH=7.4．上述3種酶活性的測定均使用Agilent Cary-100型紫外-可見分光光度計(jì)在340 nm波長下測定NADH或NADP的增減量,活性單位(U)表示為每克組織濕質(zhì)量1 min內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)．

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示．采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件,通過t-檢驗(yàn)分析同一海域南、北種群的線粒體呼吸速率和酶活性的差異,通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)多重比較分析不同海域南、北種群的線粒體呼吸速率和酶活性的差異．差異顯著和極顯著水平分別設(shè)置為p≤0.05和p≤0.01．

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體呼吸速率

在本研究中,無論是使用琥珀酸還是丙酮酸+蘋果酸作為底物,擬穴青蟹鰓、肌肉和肝胰腺線粒體的狀態(tài)2和狀態(tài)4呼吸速率的差異均很小,但狀態(tài)2或狀態(tài)4與狀態(tài)3呼吸速率則有很明顯的差異,所以本研究選擇擬穴青蟹鰓、肌肉和肝胰腺線粒體狀態(tài)2與狀態(tài)3呼吸速率的測試結(jié)果進(jìn)行分析比較.

2.1.1 鰓

如圖1所示:擬穴青蟹北方種群和南方種群的鰓線粒體呼吸速率在測試的3個(gè)海域的變化規(guī)律相似,其狀態(tài)2和狀態(tài)3呼吸速率均表現(xiàn)為寧波海域最高,儋州海域最低,漳州海域介于兩者之間,即北方種群和南方種群的鰓線粒體各狀態(tài)的呼吸速率均隨著緯度的升高而升高．在測試的3個(gè)海域,同一海域北方種群鰓線粒體呼吸速率均顯著高于同一海域南方種群(p≤0.05).其中寧波海域使用琥珀酸為底物時(shí)測得的狀態(tài)3呼吸速率：北方種群為(70.54±3.35) nmol/(min·mg),南方種群為(50.94±6.05) nmol/(min·mg).漳州海域使用琥珀酸為底物時(shí)測得的狀態(tài)2呼吸速率：北方種群為(11.17±1.93) nmol/(min·mg),南方種群為(7.23±2.05) nmol/(min·mg)；狀態(tài)3呼吸速率：北方種群為(46.88±12.76) nmol/(min·mg),南方種群為(28.02±6.12) nmol/(min·mg).上述3項(xiàng)在南、北種群間的差異極顯著(p≤0.01).

2.1.2 肌 肉

如圖2所示:寧波海域擬穴青蟹北方種群和南方種群的肌肉線粒體各狀態(tài)的呼吸速率均顯著高于漳州海域和儋州海域(p≤0.05)．將漳州海域與儋州海域進(jìn)行比較,肌肉線粒體呼吸速率在北方種群間無顯著差異(p>0.05),但在南方種群以丙酮酸+蘋果酸為底物時(shí)測得的狀態(tài)2和狀態(tài)3呼吸速率則表現(xiàn)為漳州海域顯著高于儋州海域(p≤0.05)．同一海域不同種群間肌肉線粒體呼吸速率的比較結(jié)果如下:在寧波海域,北方種群高于南方種群,其中使用琥珀酸和丙酮酸+蘋果酸為底物時(shí)測得的狀態(tài)3呼吸速率差異顯著(p≤0.05);在漳州海域,也是北方種群高于南方種群,其中使用琥珀酸為底物時(shí)測得的狀態(tài)2和狀態(tài)3呼吸速率差異顯著(p≤0.05);而在儋州海域,南、北種群間的差異不顯著(p>0.05)．

*和**分別表示同一海域的北方種群與南方種群間差異顯著(p≤0.05)和極顯著(p≤0.01);不同的大寫字母和小寫字母分別表示北方種群與南方種群在不同海域間差異顯著(p≤0.05)(下同)．圖1 不同海域擬穴青蟹北方種群和南方種群鰓線粒體的呼吸速率(n=6)Fig.1 Mitochondrial respiration rates in gill of northern and southern populations of S. paramamosain in different coastal waters (n=6)

圖2 不同海域擬穴青蟹北方種群和南方種群肌肉線粒體的呼吸速率(n=6)Fig.2 Mitochondrial respiration rates in muscle of northern and southern populations of S. paramanosain in different coastal waters (n=6)

2.1.3 肝胰腺

圖3 不同海域擬穴青蟹北方種群和南方種群肝胰腺線粒體的呼吸速率(n=6)Fig.3 Mitochondrial respiration rates in hepatopancreas of northern and southern populations of S. paramanosain in different coastal waters (n=6)

如圖3所示:在測試的3個(gè)海域,寧波海域以琥珀酸為底物時(shí)測得的擬穴青蟹北方種群的肝胰腺線粒體狀態(tài)3呼吸速率與漳州海域北方種群無顯著差異(p>0.05),除此之外,寧波海域擬穴青蟹北方種群和南方種群肝胰腺線粒體各狀態(tài)的呼吸速率均顯著高于漳州海域和儋州海域(p≤0.05)．漳州海域擬穴青蟹北方種群和南方種群肝胰腺線粒體各狀態(tài)的呼吸速率與儋州海域均無顯著差異(p>0.05)．同一海域不同種群間肝胰腺線粒體呼吸速率的比較結(jié)果表明:在寧波海域,除了以丙酮酸+蘋果酸為底物測得的狀態(tài)2呼吸速率外,其他3種狀態(tài)的呼吸速率均是北方種群顯著高于南方種群(p≤0.05);特別是以琥珀酸為底物測得的線粒體狀態(tài)3呼吸速率在南、北種群間的差異達(dá)到極顯著水平(p≤0.01),北方種群為(40.60±4.26) nmol/(min·mg),南方種群為(30.13±3.99) nmol/(min·mg)．在漳州海域,北方種群線粒體各狀態(tài)的呼吸速率也高于南方種群,其中使用琥珀酸為底物測得的狀態(tài)3呼吸速率差異顯著(p≤0.05)．在儋州海域,南、北種群線粒體各狀態(tài)的呼吸速率差異均不顯著(p>0.05)．

2.2 線粒體CCO活性

寧波、漳州和儋州海域擬穴青蟹南、北種群鰓、肌肉和肝胰腺線粒體CCO活性測定結(jié)果如圖4所示:南、北種群鰓線粒體CCO活性均是在寧波海域最高,漳州次之,儋州最低.南、北種群肌肉線粒體CCO活性也是在寧波海域最高,顯著高于漳州和儋州海域(p≤0.05).肝胰腺線粒體CCO活性有所不同,北方種群在漳州海域最高,寧波海域次之,儋州海域最低；而南方種群在漳州海域最高,顯著高于寧波和儋州海域(p≤0.05)．同一海域不同種群間線粒體CCO活性的情況如下:在寧波海域，北方種群鰓、肌肉和肝胰腺的線粒體CCO活性都顯著高于南方種群(p≤0.05),特別是鰓的線粒體CCO活性,在南、北種群間的差異達(dá)到極顯著水平(p≤0.01),北方種群鰓線粒體CCO活性為(0.441±0.067) U/mg,南方種群為(0.274±0.058) U/mg;在漳州海域，北方種群鰓和肝胰腺的線粒體CCO活性也顯著高于南方種群(p≤0.05)，北方種群分別為(0.266±0.030) U/mg和(0.246±0.027) U/mg，南方種群分別為(0.168±0.048) U/mg和(0.210±0.020) U/mg;在儋州海域，肌肉和肝胰腺的線粒體CCO活性在南、北種群間的差異不顯著(p>0.05),鰓的線粒體CCO活性在南、北種群間則有顯著性差異(p≤0.05),北方種群為(0.132±0.023) U/mg,南方種群為(0.097±0.017) U/mg．

2.3 肌肉中相關(guān)酶的活性

圖4 不同海域擬穴青蟹北方種群和南方種群的線粒體CCO活性(n=6)Fig.4 Mitochondrial CCO activities of northern and southern populations of S. paramamosain in different coastal waters (n=6)

圖5 不同海域擬穴青蟹北方種群和南方種群肌肉LDH、PK和HK的活性(n=6)Fig.5 LDH,PK and HK activities in muscle of northern and southern populations of S. paramamosain in different coastal waters (n=6)

擬穴青蟹南、北種群肌肉LDH、PK和HK活性在不同海域的情況比較復(fù)雜,如圖5所示:漳州海域的南方種群肌肉LDH活性顯著高于寧波和儋州海域的南方種群(p≤0.05),而北方種群肌肉LDH活性在測試的3個(gè)海域間無顯著差異(p>0.05).漳州海域的南方種群肌肉PK活性也顯著高于寧波和儋州海域的南方種群(p≤0.05),而北方種群肌肉PK活性僅顯著高于儋州海域的北方種群(p≤0.05).寧波海域的南方種群肌肉HK活性僅顯著高于儋州海域的南方種群(p≤0.05)；而北方種群肌肉HK活性在測試的3個(gè)海域間差異顯著(p≤0.05),寧波海域最高,漳州海域次之,儋州海域最低．同一海域的南、北種群間肌肉LDH、PK和HK活性的比較結(jié)果顯示:寧波海域擬穴青蟹北方種群HK活性顯著高于該海域的南方種群(p≤0.05),北方種群HK活性為(10.79±1.13) U/mg,南方種群HK活性為(9.02±1.20) U/mg,除此之外,其余均無顯著性差異(p>0.05)．

3 討 論

擬穴青蟹是生活在熱帶和亞熱帶海域的蟹類,在溫度較高時(shí)進(jìn)行生長發(fā)育和繁殖,低溫時(shí)攝食和運(yùn)動(dòng)量則大為減少[9]．?dāng)M穴青蟹分布于我國東南沿海海域,位于北部的浙江省寧波海域?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候,四季分明,夏季高溫,冬季水溫較低,可低至5 ℃以下;位于南部的海南省儋州海域?qū)贌釒Ъ撅L(fēng)氣候,四季不分明,長夏無冬,在最冷的一、二月份水溫仍可達(dá)到16～21 ℃;位于上述兩海域之間的福建省漳州海域,其氣候也介于兩者之間[19]．由于我國東南沿海不同海域的氣候條件相差較大,而且是擬穴青蟹的分布北界,不同地理群體的擬穴青蟹很可能在遺傳或表型上出現(xiàn)差異,從而分化為南、北2個(gè)種群．倘若分布于我國的擬穴青蟹的確已分化為南、北2個(gè)種群,則兩者對低溫環(huán)境的適應(yīng)能力、溫度補(bǔ)償機(jī)制以及生理生化的響應(yīng)也應(yīng)有所不同．為此,本研究在上述3個(gè)不同緯度的海域采集低溫季節(jié)的擬穴青蟹野生樣品,采樣時(shí)間為2010年11月、2010年12月和2011年1月,分別為秋末、初冬和中冬,此時(shí)這3個(gè)海域的水溫均是一年中較低的時(shí)候．通過分析3個(gè)海域不同種群的擬穴青蟹在低溫季節(jié)的線粒體呼吸速率、CCO活性以及肌肉LDH、PK、HK活性，判斷分布于我國東南沿海的擬穴青蟹種群分化情況以及不同種群的分布規(guī)律．結(jié)果表明,上述3個(gè)海域不同種群的擬穴青蟹在低溫季節(jié)的線粒體呼吸速率、CCO活性以及肌肉LDH、PK、HK活性存在顯著差異,由此證實(shí)了分布于我國的擬穴青蟹已分化為南、北2個(gè)種群的推測,且南、北種群的個(gè)體混雜分布于我國的不同海域．

3.1 不同種群線粒體呼吸速率和CCO活性的差異

本研究結(jié)果顯示,在寧波、漳州和儋州這3個(gè)海域的低溫季節(jié),擬穴青蟹北方種群的線粒體呼吸速率整體上均高于本海域的南方種群,緯度越高的海域這種差異越明顯．在緯度較高的寧波海域,北方種群鰓、肌肉和肝胰腺的線粒體呼吸速率顯著高于南方種群,特別是這3種組織的線粒體狀態(tài)3呼吸速率,北方種群均顯著高于南方種群;在漳州海域,北方種群這3種組織的線粒體呼吸速率也顯著高于南方種群,其中在鰓中差異最顯著;在緯度較低的儋州海域,北方種群鰓線粒體呼吸速率顯著高于南方種群,而肌肉和肝胰腺組織的線粒體呼吸速率在南、北種群間未呈現(xiàn)顯著性差異．由此可見,在低溫環(huán)境下北方種群的線粒體對溫度的補(bǔ)償比南方種群更為有效,而且緯度越高,南、北種群間的差異越明顯．這個(gè)結(jié)果與本課題組先前測定的擬穴青蟹南、北種群線粒體功能和代謝酶活性的季節(jié)變化結(jié)果[12]是一致的．

擬穴青蟹鰓、肌肉和肝胰腺線粒體CCO活性與其線粒體呼吸速率的情況相似,在測試的3個(gè)不同海域均表現(xiàn)為北方種群整體上高于南方種群,特別是緯度較高的寧波海域,南、北種群間的差異達(dá)到顯著性水平．此外,擬穴青蟹鰓的線粒體呼吸速率和CCO活性在南、北種群間的差異很明顯,在測試的3個(gè)不同海域均是北方種群顯著高于南方種群．這個(gè)結(jié)果再次表明,在低溫環(huán)境下北方種群比南方種群有更高的溫度補(bǔ)償效率．?dāng)M穴青蟹南、北種群線粒體呼吸速率的差異與其CCO活性的差異相似,這是因?yàn)镃CO是線粒體呼吸作用中重要的催化酶,二者是相互關(guān)聯(lián)的,所以表現(xiàn)出一致性的規(guī)律．在其他動(dòng)物中,如不同發(fā)育階段的鳉魚(Austrofunduluslimnaeus)的線粒體呼吸速率與CCO活性也有類似的情況[16]．

擬穴青蟹鰓線粒體呼吸速率和CCO活性的種群間差異明顯高于肌肉和肝胰腺組織的種群間差異．在測試的3個(gè)海域,擬穴青蟹鰓線粒體的呼吸速率和CCO活性的種群間差異均達(dá)到顯著性水平;在漳州和儋州海域,肌肉和肝胰腺的線粒體呼吸速率和CCO活性的種群間差異則明顯低于鰓的種群間差異．這可能是因?yàn)閿M穴青蟹鰓在體液滲透壓調(diào)節(jié)中直接與外界環(huán)境接觸,受外界水溫變化影響最大[20-21]．由此可見,擬穴青蟹南、北種群的差異不僅表現(xiàn)在細(xì)胞水平上,也表現(xiàn)在組織水平上．

3.2 不同種群代謝補(bǔ)償?shù)牟町?/h3>

一般而言,當(dāng)環(huán)境溫度降低時(shí),為了彌補(bǔ)低溫對新陳代謝的抑制,在低溫下依舊保持活力的動(dòng)物的機(jī)體調(diào)控系統(tǒng)會(huì)通過溫度補(bǔ)償機(jī)制來提高代謝速率,從而維持正常的生命活動(dòng)[22-24]．緯度越高的地區(qū)氣溫變化越明顯,生活在高緯度地區(qū)的動(dòng)物會(huì)比生活在低緯度地區(qū)的動(dòng)物面臨更極端的環(huán)境溫度變化,因此在寒冷季節(jié)同一物種的高緯度地理種群的代謝水平會(huì)比低緯度的地理種群更具溫度補(bǔ)償效率,從而維持同等的生長繁殖活動(dòng)[25-27]．

本研究的結(jié)果顯示,不論是擬穴青蟹的南方種群還是北方種群,在緯度較高的寧波海域其線粒體呼吸速率都較高,在緯度較低的儋州海域其線粒體呼吸速率都較低．除了肝胰腺線粒體CCO活性之外,擬穴青蟹南、北種群鰓和肌肉線粒體CCO活性基本也呈現(xiàn)該趨勢．雖然擬穴青蟹南、北種群其LDH和PK活性在測試的3個(gè)海域未呈現(xiàn)該趨勢,但其HK活性也是寧波海域顯著高于儋州海域．因此,從整體上來看,無論是南方種群還是北方種群,生活在較高緯度海域的擬穴青蟹個(gè)體的線粒體功能和代謝酶活性都明顯高于生活在較低緯度海域的個(gè)體,即生活在較高緯度海域的擬穴青蟹個(gè)體具有更高的代謝補(bǔ)償效應(yīng)．

總體而言,我國東南沿海擬穴青蟹北方種群對低溫的代謝補(bǔ)償比南方種群更為有效,在緯度較高的海域更是如此．當(dāng)?shù)蜏赜绊懙綌M穴青蟹的新陳代謝時(shí),南方種群可能會(huì)減少活動(dòng)甚至進(jìn)入休眠狀態(tài),而北方種群則依舊能保持較高的代謝速率,從而維持正常的生命活動(dòng)．北方種群的這種生理特性使其比南方種群更適合在我國東南沿海緯度較高的海域生活,因此,在我國東南沿海不同緯度的海域,擬穴青蟹北方種群的個(gè)體數(shù)量隨緯度的升高而增加．?dāng)M穴青蟹在我國東南沿海的這種分化情況及其分布規(guī)律在養(yǎng)殖上應(yīng)予以重視,對不同的種群在養(yǎng)殖上要區(qū)別對待．

3.3 擬穴青蟹線粒體代謝與細(xì)胞基質(zhì)代謝的差異

值得進(jìn)一步討論的是，與肌肉線粒體呼吸速率和CCO活性相比,擬穴青蟹肌肉LDH和PK活性在南、北種群間的差異很小,均未達(dá)到顯著性水平．LDH和PK是存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的代謝酶,擬穴青蟹這2種酶活性的種群間差異不及線粒體呼吸速率和CCO活性的種群間差異顯著,說明擬穴青蟹南、北種群在線粒體代謝水平上的差異比在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)上的差異明顯．Dhillon等[25]在底鳉(Fundulusheteroclitus)南、北種群的研究中報(bào)道了類似的情況,在不同馴化溫度下不同種群底鳉的肌肉檸檬酸合成酶(CS)和LDH的活性有明顯差異．CS是線粒體呼吸作用中的另一關(guān)鍵酶,在5和15 ℃的低溫條件下北方種群CS活性顯著高于南方種群,而在任一馴化溫度下南、北種群LDH活性均無顯著差異，說明底鳉南、北種群也是線粒體代謝水平上的差異比細(xì)胞基質(zhì)上的差異明顯．

綜上，本研究對我國東南沿海南、北種群的擬穴青蟹的線粒體呼吸速率、CCO活性以及肌肉LDH、PK、HK活性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，分布于我國東南沿海的擬穴青蟹北方種群比南方種群對溫度有更有效的代謝補(bǔ)償能力，且緯度越高，二者的差異越顯著。此結(jié)果為擬穴青蟹的種群分化以及擬穴青蟹養(yǎng)殖模式的建立提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，具有理論意義和實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

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