HPLC法同時(shí)測(cè)定蒙藥達(dá)烏里芯芭中梓醇和益母草苷的含量Δ

包玉秋，那仁朝克圖（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院臨床蒙藥劑部，內(nèi)蒙古通遼028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

達(dá)烏里芯芭，蒙名為阿拉藤-艾給，俗名大黃花，為玄參科植物達(dá)烏里芯芭（Cymbaria dahuricaL.）的干燥全草。夏季花開(kāi)時(shí)采收，曬干。味微苦，性涼。作為傳統(tǒng)蒙藥之一，達(dá)烏里芯芭具有燥協(xié)日烏素、清熱、止痛、止血、止癢消腫等功效，用于心、肺、腎等臟器急熱，疫熱，關(guān)節(jié)協(xié)日烏素病，協(xié)日烏素瘡，關(guān)節(jié)疼痛，外傷，膿瘍，膿腫，傷口滲血等[1]。達(dá)烏里芯芭記載于《認(rèn)藥白晶鑒》和《無(wú)誤蒙藥鑒》中。1998年版《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（蒙藥分冊(cè)）收載了達(dá)烏里芯芭，但是到目前為止還未建立該藥材的檢查、薄層鑒別和含量測(cè)定等項(xiàng)[2]。蒙藥材達(dá)烏里芯芭中具有生物活性的化學(xué)成分為黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、甾醇類、肉桂酸衍生物等[3-7]，其主要成分為環(huán)烯醚萜苷類，梓醇和益母草苷即屬于環(huán)烯醚萜苷類成分。筆者已從達(dá)烏里芯芭全草的乙醇提取物中分離出含量較高的梓醇和益母草苷這2種成分，并且這2種成分具有抗炎、保護(hù)心臟等生物活性，這一活性與達(dá)烏里芯芭的功效燥協(xié)日烏素和治療心、肺、腎等臟器急熱作用基本吻合。因此，筆者在本研究中建立同時(shí)測(cè)定達(dá)烏里芯芭中梓醇和益母草苷含量的方法[8]，為達(dá)烏里芯芭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀，包括G1312C輸液泵、G1315D二極管陳列檢測(cè)器、G1329B進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱（美國(guó)Agilent公司）；MS105電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；N1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（德國(guó)Merck-Millipore公司）；DL450A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。

1.2 藥材

7批達(dá)烏里芯芭于2017年5月30日采集自內(nèi)蒙古通遼市科左后旗阿古拉草原（批號(hào)分別為DWLXB-001～DWLXB-007），由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥學(xué)教研室布和巴特爾教授鑒定為玄參科植物達(dá)烏里芯芭Cymbaria dahuricaL.的干燥全草，使用時(shí)取達(dá)烏里芯芭干燥全草粉碎后過(guò)4號(hào)篩。

1.3 對(duì)照品與試劑

對(duì)照品梓醇和益母草苷均由課題組那仁朝克圖等對(duì)達(dá)烏里芯芭前期化學(xué)成分分離精制得到[4]，批號(hào)分別是XB-ZC-001和XB-YMCG-001，經(jīng)峰面積歸一化法確定純度均≥98%。乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：XSelect HSS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脫（0～10 min，93%→85%B；10～20 min，85%→76%B；20～35 min，76%→55%B；35～40 min，55%→93%B）；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取梓醇對(duì)照品4.25 mg、益母草苷對(duì)照品6.25 mg，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.17 mg的梓醇對(duì)照品溶液和每1 mL含0.25 mg的益母草苷混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取達(dá)烏里芯芭粉末1.0 g，置于圓底燒瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取1.0 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾（0.45 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、混合對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，待測(cè)成分間、待測(cè)成分與雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，其他成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)影響，梓醇和益母草苷的理論板數(shù)均不低于3 000，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按5、10、15、20、25、30 μL等6個(gè)不同體積進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得梓醇、益母草苷的回歸方程分別為y＝79 537x+13 918（r＝0.999 6）、y＝83 737x+19 108（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，梓醇、益母草苷進(jìn)樣量分別在0.17～3.4、0.25～5.0 μg范圍內(nèi)與各自的峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，測(cè)得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，測(cè)得定量限。結(jié)果，梓醇、益母草苷的檢測(cè)限分別為3.57、4.72 ng，定量限分別為12.24、41.98 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，梓醇、益母草苷峰面積的RSD分別為1.54%、1.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批（批號(hào)：DWLXB-007）達(dá)烏里芯芭供試品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，梓醇、益母草苷峰面積RSD分別為1.32%、1.60%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批（批號(hào)：DWLXB-007）達(dá)烏里芯芭供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，梓醇、益母草苷峰面積RSD分別為1.28%、1.41%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：DWLXB-007）適量，共6份，每份約0.5 g，精密加入梓醇和益母草苷混合對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

由表1結(jié)果顯示，梓醇加樣回收率為93.0%～97.3%，RSD為1.9%（n＝6），益母草苷回收率為92.1%～97.9%，RSD為2.4%（n＝6），表明本試驗(yàn)所采用的測(cè)定方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于樣品測(cè)定。

2.10 樣品含量測(cè)定

取7批達(dá)烏里芯芭藥材粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的含量。結(jié)果顯示，7批樣品中梓醇、益母草苷含量分別為0.53～0.81、0.79～1.25 mg/g，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 7批樣品的含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab 2 Result of content determination of 7 batches of samples（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 提取方法與流動(dòng)相的考察

在前期試驗(yàn)中，筆者在提取方法的選擇時(shí)分別考察了氯仿超聲提取、氯仿∶甲醇（1∶1，V/V）超聲提取、50%甲醇回流提取、70%甲醇回流提取和甲醇回流提取等方法，結(jié)果表明采用甲醇回流提取時(shí)各指標(biāo)成分提取率較高。筆者在流動(dòng)相選擇時(shí)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水和乙腈-0.4%磷酸水，結(jié)果選用乙腈-0.4%磷酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)分離度較高。

3.2 對(duì)照品及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

目前梓醇已被2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[9]作為地黃的標(biāo)準(zhǔn)品，筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知梓醇和益母草苷具有抗炎、降糖、抗腫瘤和保護(hù)心臟等作用[10-13]，與達(dá)烏里芯芭的功效燥協(xié)日烏素和治療心、肺、腎等臟器急熱作用基本吻合。在波長(zhǎng)的選擇時(shí)，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)供試品及梓醇、益母草苷對(duì)照品進(jìn)行200～800 nm全波長(zhǎng)掃描得知最大吸收波長(zhǎng)為203 nm處，因此選擇203 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 加樣回收試驗(yàn)的討論

加樣回收率已達(dá)到2015年版《中國(guó)藥典》（四部）規(guī)定的待測(cè)成分含量0.1%，回收率限度90%～108%的定量要求[14]，RSD為2.4%，因天然藥物的成分具有復(fù)雜性和多樣性，其成分的含量為0.01%～0.1%時(shí)RSD的限度范圍可放寬。

3.4 含量測(cè)定方法的選擇

蒙藥材達(dá)烏里芯芭的質(zhì)量控制方法目前只有顯微鑒別和薄層鑒別，還未建立含量測(cè)定項(xiàng)，因此為了有效地控制達(dá)烏里芯芭的質(zhì)量，有必要建立含量測(cè)定方法，提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。從近幾年的文獻(xiàn)報(bào)道中筆者發(fā)現(xiàn)，以梓醇為對(duì)照品測(cè)定芯芭的含量[15]文獻(xiàn)有1篇，芯芭藥材來(lái)源有蒙古芯芭和達(dá)烏里芯芭，從國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究趨勢(shì)可看出天然藥物的質(zhì)量控制方法[16-17]向儀器化和成分的代表性及多樣化方向發(fā)展。因此，選擇具有代表性和專屬性的指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制的意義重大。

綜上，本研究所建立的方法快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，可用于達(dá)烏里芯芭中梓醇和益母草苷含量的同時(shí)測(cè)定。

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