炮制方法及提取溶劑對(duì)何首烏中主要成分含量的影響Δ

朱 敏，姚 毅，居文政，劉志輝，方祝元（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，南京 210036）

何首烏首載于《開寶本草》，為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorumThunb.）的干燥塊根，臨床使用有生熟之分，生何首烏苦、甘、澀，微溫，功能為解毒消癰、截瘧、潤(rùn)腸通便。制何首烏為生何首烏經(jīng)蒸或煮后的炮制品，善補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨[1]，為滋補(bǔ)良藥。含何首烏的復(fù)方制劑目前已廣泛用于高脂血癥、血管性癡呆、脫發(fā)、慢性肝炎、肝纖維化等多種疾病的治療[2-3]。隨著何首烏制劑的廣泛應(yīng)用，近年來，國內(nèi)外臨床上陸續(xù)出現(xiàn)因服用何首烏或含何首烏的制劑引起黃疸、肝功能異常、急性中毒性肝炎、慢性乙型肝炎等肝損傷的病例[4-7]，引起了各國對(duì)何首烏及其制劑安全性的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代研究結(jié)果顯示，何首烏中主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、磷脂類及鞣質(zhì)類成分，其中二苯乙烯苷類成分、大黃素等蒽醌類成分以及鞣質(zhì)類成分與其肝毒性關(guān)系較大[8-10]，不同提取溶劑提取后樣品對(duì)何首烏的肝細(xì)胞毒性也有較大影響[11]，本研究以何首烏生品及其不同方法的炮制品為研究對(duì)象，考察不同提取溶劑提取后對(duì)何首烏中所含沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚含量的影響，為規(guī)范何首烏的炮制及提取方法提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695-2996型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BP-211D型電子天平（德國Sartorius公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；MZ-SYH26-2CB型電蒸鍋（美的集團(tuán)股份有限公司）；KQ-1000型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

生何首烏、制何首烏飲片均購自安徽省萬生中藥飲片有限公司（批號(hào)均為150301），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院朱育鳳主任中藥師鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根及其炮制品；黑豆（市售）；沒食子酸（批號(hào)：141109）、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（以下簡(jiǎn)稱二苯乙烯苷，批號(hào)：16081506）、大黃素（批號(hào)：151008）、大黃素甲醚（批號(hào)：17022010）4種對(duì)照品均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司（純度：均≥98%）；甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Symmetry-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，10%→80%A；30～40 min，80%→90%A；40～45 min，90%A；45～48 min，90%→10%A），流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm（沒食子酸）、320 nm（二苯乙烯苷）、254 nm（大黃素、大黃素甲醚）。取各供試品溶液及混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。各待測(cè)成分與相鄰峰之間的分離度均＞1.5，表明各成分互不干擾。

2.2 采用不同溶劑提取生品與炮制品

2.2.1 何首烏生品（S） 稱取何首烏飲片生品4份，每份200 g，分別加8倍量溶劑（①水；②50%乙醇；③70%乙醇；④90%乙醇）浸泡1 h后，提取2次，合并2次提取液，減壓濃縮干燥得干浸膏S1（水提生品）、S2（50%乙醇提生品）、S3（70%乙醇提生品）、S4（90%乙醇提生品）。

2.2.2 何首烏制品（Z） 稱取市售何首烏制品4份，每份200 g，分別加8倍量溶劑（①水；②50%乙醇；③70%乙醇；④90%乙醇）浸泡1 h后，提取2次，合并2次提取液，濃縮干燥得干浸膏Z1（水提制品）、Z2（50%乙醇提制品）、Z3（70%乙醇提制品）、Z4（90%乙醇提制品）。

2.2.3 何首烏清蒸品（Q） 清蒸方法依據(jù)為2015年版《中國藥典》（一部）方法[1]。取何首烏生品適量，加清水拌勻，潤(rùn)透，置于電蒸鍋內(nèi)，蒸汽加熱至內(nèi)外均呈棕褐色（每次加熱約30 min，放涼后再加熱，如此反復(fù)6次），切片干燥即得。取所得何首烏清蒸品4份，每份200 g，分別加8倍量溶劑（①水；②50%乙醇；③70%乙醇；④90%乙醇）浸泡1 h后，提取2次，合并2次提取液，濃縮干燥得干浸膏Q1（水提清蒸品）、Q2（50%乙醇提清蒸品）、Q3（70%乙醇提清蒸品）、Q4（90%乙醇提清蒸品）。

2.2.4 何首烏黑豆汁蒸品（H） 取何首烏生品適量，加黑豆汁拌勻，潤(rùn)透，置于電蒸鍋內(nèi)，蒸汽加熱至內(nèi)外均呈棕褐色（每次加熱約30 min，放涼后再加熱，如此反復(fù)6次），切片干燥即得。取所得何首烏黑豆汁蒸品4份，每份200 g，分別加8倍量溶劑（①水；②50%乙醇；③70%乙醇；④90%乙醇）浸泡1 h后，提取2次，合并2次提取液，濃縮干燥得干浸膏H1（水提黑豆汁蒸品）、H2（50%乙醇提黑豆汁蒸品）、H3（70%乙醇提黑豆汁蒸品）、H4（90%乙醇提黑豆汁蒸品）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱定沒食子酸、二苯乙烯苷（避光操作）、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品適量，用甲醇溶解后，制成質(zhì)量濃度分別為5.06、4.53、1.29、2.66mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別取適量置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.51、0.45、0.13、0.27 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 精密稱取“2.2”項(xiàng)各干浸膏適量，加80%甲醇超聲（功率：280 W，頻率：53 kHz）溶解定容，離心（離心半徑為7 cm，轉(zhuǎn)速為13 000 r/min）10 min，取上清液即得。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，倍比稀釋，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x，μg），進(jìn)行線性回歸，得各成分的回歸方程和線性范圍；同時(shí)取該系列對(duì)照品溶液，逐漸稀釋，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限。線性關(guān)系與定量限測(cè)定結(jié)果詳見表1。

表1 線性關(guān)系與定量限測(cè)定結(jié)果Tab 1 Measurement results of linear relationship and limit of quantification

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄所測(cè)各成分的峰面積值。結(jié)果，沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.08%、0.17%、0.25%、0.29%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液S1、S3，分別于室溫下存放0、5、10、20、30、48 h后進(jìn)樣檢測(cè)，記錄供試品中各成分的峰面積。結(jié)果，同一樣品中各成分在48 h內(nèi)峰面積的RSD均不大于2.00%（n＝6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備S1、S3供試品溶液，各6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄待測(cè)各成分的峰面積。結(jié)果，2種供試品溶液中各成分峰面積的RSD均不大于3.00%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知4種成分含量的樣品S1、S3各6份，分別精密加入一定量的對(duì)照品，制備供試品溶液，測(cè)定含量。計(jì)算得S1中沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為96.34%、100.66%、102.09%、98.78%，RSD均不大于3.00%（n＝6）；S3樣品中沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為102.92%、101.75%、104.47%、98.61%，RSD均不大于3.00%（n＝6）。

2.9 樣品含量測(cè)定結(jié)果

各供試品溶液及混合對(duì)照品溶液的色譜峰見圖1；依據(jù)各待測(cè)成分色譜峰峰面積，計(jì)算供試品中待測(cè)成分的含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

由表2可知，何首烏炮制品（Z、H、Q）中二苯乙烯苷、沒食子酸、大黃素、大黃素甲醚的含量均比生品（S）高。

以水為提取溶劑時(shí)，市售制何首烏飲片（Z1）較清蒸品（Q1）、黑豆汁蒸品（H1）中沒食子酸的含量高；大黃素和大黃素甲醚的含量較低；黑豆汁蒸品中（H1）沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素的含量均低于清蒸品（Q1）。

以50%乙醇為提取溶劑時(shí)，市售制何首烏飲片（Z2）中沒食子酸、二苯乙烯苷和大黃素的含量均高于清蒸品（Q2）、黑豆汁蒸品（H2）；黑豆汁蒸品（H2）中沒食子酸、二苯乙烯苷的含量均低于清蒸品（Q2），大黃素、大黃素甲醚的含量均高于清蒸品（Q2）。

以70%乙醇為提取溶劑時(shí)，市售制何首烏飲片（Z3）中二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量則均低于清蒸品（Q3）和黑豆汁蒸品（H3），沒食子酸的含量則較后兩者高；黑豆汁蒸品（H3）中二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量高于清蒸品（Q3），沒食子酸的含量則較清蒸品（Q3）低。

以90%乙醇為提取溶劑時(shí)，上述4種成分在市售制何首烏中的含量均低于清蒸品（Q4）和黑豆汁蒸品（H4），黑豆汁蒸品（H4）中沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量均高于清蒸品（Q4）。

總的說來，3種何首烏炮制品的4種提取液中4種主要成分的含量均較生品中更高；沒食子酸以水提時(shí)含量最高，二苯乙烯苷以90%乙醇提取時(shí)含量最低，大黃素和大黃素甲醚以50%和70%乙醇提取時(shí)含量較高；各炮制品中各成分的含量變化未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。

3 討論

何首烏主要含有二苯乙烯類、蒽醌、磷脂、多糖及鞣質(zhì)類成分[12]，毒性成分的研究結(jié)果顯示，其中的二苯乙烯苷，大黃素、大黃酚、大黃酸等蒽醌類以及鞣質(zhì)類成分均有不同程度的肝毒性[13-15]，然而大黃素等蒽醌類成分在其他中藥中卻未見有致肝損傷不良反應(yīng)的報(bào)道，有研究表明蒽醌類成分尚具有保肝作用[16]。鞣質(zhì)類成分雖有毒性相關(guān)的報(bào)道，但大多數(shù)中藥中均含有鞣質(zhì)，與肝毒性的發(fā)生不一定有相關(guān)性。何首烏中的二苯乙烯苷在2015年版《中國藥典》（一部）中也是作為控制何首烏飲片質(zhì)量的指標(biāo)性成分?？梢?，現(xiàn)階段關(guān)于何首烏致肝損傷物質(zhì)基礎(chǔ)的研究結(jié)果尚存在很大爭(zhēng)議，部分結(jié)論甚至是對(duì)立的，研究認(rèn)為，何首烏炮制后能降低其毒性，但炮制前后主要成分的含量變化，文獻(xiàn)中的研究結(jié)論也存在較大差異[17-20]。

各版《中國藥典》（1964版－2015版）中記載何首烏的炮制方法，主要為蒸或燉，所用輔料主要為水、黑豆汁和黃酒[1，21-22]，2015年版《中國藥典》（一部）中采用稀乙醇和甲醇加熱回流的方法處理樣品，對(duì)指標(biāo)性成分二苯乙烯苷和蒽醌類成分分別進(jìn)行含量測(cè)定，據(jù)此，本研究選用清蒸和黑豆汁蒸這2種方法對(duì)生首烏進(jìn)行炮制，并用水及不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)炮制前后的何首烏分別進(jìn)行提取，用甲醇-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行目標(biāo)成分的含量測(cè)定。研究結(jié)果顯示，在本研究所用提取及檢測(cè)方法下，各待測(cè)成分出峰情況較好，且分離效果較好。何首烏經(jīng)炮制后，其主要成分二苯乙烯苷、鞣質(zhì)類水解產(chǎn)物沒食子酸及游離蒽醌類成分大黃素、大黃素甲醚的含量較生品均升高，其中二苯乙烯苷成分對(duì)光不穩(wěn)定，需在避光條件下制備；市售制首烏飲片與傳統(tǒng)清蒸、黑豆汁蒸何首烏在上述成分的含量上沒有呈現(xiàn)有規(guī)律性的差異變化。本研究還發(fā)現(xiàn)，4種成分的含量與提取溶劑有較大的關(guān)系，沒食子酸在水提液中比醇提液中含量高，二苯乙烯苷以90%乙醇提取后含量較低，大黃素和大黃素甲醚以50%和70%乙醇提取后含量較高。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表2各樣品含量測(cè)定結(jié)果[n＝3，mg/g（生藥）]Tab 2 Results of content determination of samples[n＝3，mg/g（crude drug）]

現(xiàn)代研究認(rèn)為，何首烏炮制后能顯著降低其毒性[23]，但2015年版《中國藥典》（一部）中卻未明確規(guī)定何首烏的炮制工藝參數(shù)，炮制工藝參數(shù)的不一致直接導(dǎo)致何首烏中成分的組成和含量的變化，從而產(chǎn)生不同程度的毒副作用。因此，何首烏減毒增效炮制工藝的規(guī)范化研究是其現(xiàn)代研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。

從現(xiàn)有研究結(jié)果看，毒性的改變不僅僅是炮制前后單一成分含量降低或升高的結(jié)果，可能與各主要成分含量的比例及成分間的相互作用有關(guān)，筆者后續(xù)將從成分相互作用的角度進(jìn)一步研究何首烏炮制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，為何首烏炮制機(jī)制的闡釋提供依據(jù)。

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