HPLC-QAMS同時(shí)測(cè)定復(fù)方黃芩片中6種活性成分的含量

胡 丹（宿州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，安徽宿州 234000）

復(fù)方黃芩片由黃芩、虎杖、穿心蓮和十大功勞4味中藥材組成，具有清熱解毒、涼血消腫之功效，用于咽喉腫痛、口舌生瘡、感冒發(fā)熱、癰腫瘡瘍[1]。黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分，有清熱燥濕、瀉火解毒的功效；虎杖中含有虎杖苷，有抗菌消炎、利濕退黃、清熱解毒、止咳化痰的功效；穿心蓮中含有穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯，具有清熱解毒、涼血消腫的功效[2]。已有針對(duì)虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道[2-8]，但是涉及到多種成分同時(shí)測(cè)定時(shí)需要對(duì)照品數(shù)量多，但某些對(duì)照品提純難度大，使用成本較高。一測(cè)多評(píng)法（QAMS）的廣泛應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了以樣品中某一廉價(jià)易得的對(duì)照品為內(nèi)參對(duì)多種有效成分質(zhì)量的同步控制的要求，該方法在中成藥及中藥飲片質(zhì)量控制中得到了較廣泛的應(yīng)用[9-13]，但采用QAMS法測(cè)定復(fù)方黃芩片的有效成分的含量尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了高效液相色譜（HPLC）-QAMS法同時(shí)測(cè)定復(fù)方黃芩片中6種活性成分的含量，以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯與其之間的相對(duì)校正因子（RCF），利用RCF測(cè)定各組分含量，并將結(jié)果與外標(biāo)法（ESM）測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

1 材料

1.1 儀器

e2695 Waters HPLC儀，包括2695 Alliance四元梯度泵、2695 Alliance自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower3色譜工作站、2998二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；1260 Infinity HPLC儀，包括G1311C四元梯度泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent EZchrom色譜工作站、G4212B二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；3000 Ultimate HPLC儀，包括HPG-3x00A二元泵、Split-Loop自動(dòng)進(jìn)樣器、Chromeleon 7色譜工作站、PDA-3000二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Quintix 224萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；D115烘箱（德國(guó)Binder公司）；SP3-100AL超聲波清洗機(jī)（上海泗裴電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方黃芩片（肇慶星湖制藥有限公司，批號(hào)：1702062、1703078、1708045、1708067、1709023，規(guī)格：每片0.33 g）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201619，純度：93.5%）、虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)：111575-201603，純度：87.3%）、漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：112002-201501，純度：98.8%）、黃芩素對(duì)照品（批號(hào)：111595-201306，純度：97.8%）、穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110797-201108，純度：98.7%）、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110854-201508，純度：99.4%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 QAMS法概念與原理

QAMS法是通過(guò)中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過(guò)測(cè)定中藥中某個(gè)代表性成分（易得、廉價(jià)、有效）的含量，依據(jù)RCF計(jì)算出該中藥中其他多種待測(cè)成分（對(duì)照品難以得到或難供應(yīng)）的含量，使其計(jì)算值與實(shí)測(cè)值符合定量方法學(xué)要求的一種多指標(biāo)質(zhì)量同步控制方法[14]。在一定線性范圍內(nèi)某成分的量（質(zhì)量或濃度）與檢測(cè)器響應(yīng)值成正比，即f＝A/C（f為校正因子，A表示響應(yīng)值，C表示濃度）。QAMS是以藥材中某一典型組分s（一般該組分對(duì)照品易得、廉價(jià)）為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物s與其他待測(cè)組分k之間的RCF（fk/s），即fk/s＝fk/fs＝（Ak×Cs）/（Ck×As），再通過(guò)校正因子計(jì)算其他組分的含量Ck＝（Cs×Ak）/（As×fk/s）[15]。

2.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，5%→15%A；12～25 min，15%→30%A；25～40 min，30%→45%A；40～50 min，45%→55%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm（0～7 min虎杖苷）、275 nm（7～15 min黃芩苷）、225 nm（15～23 min穿心蓮內(nèi)酯）、275 nm（23～37 min漢黃芩苷、黃芩素）、254 nm（37～50 min脫水穿心蓮內(nèi)酯）；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品各適量，置于同一100 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 mL含虎杖苷182.2 μg、黃芩苷1 881.2 μg、漢黃芩苷509.2 μg、黃芩素 515.2 μg、穿心蓮內(nèi)酯 105.3 μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯140.3 μg的混合對(duì)照品溶液，室溫避光保存，備用。

2.3.2 供試品溶液 取復(fù)方黃芩片20片，去除糖衣，研細(xì)，得復(fù)方黃芩片細(xì)粉。取復(fù)方黃芩片細(xì)粉約1 g，精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加入30 mL 50%甲醇溶液，室溫超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min后取出，放冷，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得，室溫避光保存。

2.3.3 陰性樣品溶液 按照復(fù)方黃芩片處方工藝分別制備不含虎杖、黃芩和穿心蓮的陰性樣品，按供試品溶液制備和測(cè)定方法進(jìn)行處理，即得。

2.3.4 空白溶劑 取適量甲醇作為空白溶劑。

2.4 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)

在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果各組分與前后峰分離度均大于1.8，對(duì)稱因子在1.12～1.45之間，理論板數(shù)以虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)均＞5 000。陰性樣品溶液色譜圖中在與樣品中虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯保留時(shí)間相應(yīng)位置上未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明其他藥味對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置于同一20 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯在試驗(yàn)范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表1。

2.6 檢測(cè)限與定量限考察

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of linear range investigation（n＝6）

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)即為檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)即為定量限。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)限分別為2.25、6.92、1.76、4.69、1.37、1.51 ng，定量限分別為 6.89、19.98、5.28、13.81、4.15、4.71 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.53%、1.02%、1.18%、0.85%、0.76%、0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：1702062），分別于制備后0、3、6、9、12、24、48 h按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.35%、0.56%、0.52%、0.62%、0.92%、0.43%、0.89%（n＝7），表明供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)：1702062），按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算6種成分的含量及其RSD值。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均含量分別為2.14、22.56、5.85、6.05、1.36、1.65 mg/g，RSD分別為0.59%、0.41%、0.89%、1.02%、0.85%、1.12%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的復(fù)方黃芩片（批號(hào)：1702062）細(xì)粉，共9份，每份約0.5 g，分成3組，精密稱定后分別置于50 mL棕色量瓶中，分別加入“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液4、6、8 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各成分加樣回收率及其RSD值。結(jié)果，虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為98.2%、98.8%、97.9%、98.9%、98.8%、98.7%，RSD分別為1.32%、1.14%、1.23%、1.00%、0.91%、1.12%（n＝9）。

2.11 RCF的計(jì)算

在標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝ax+b中，x＝（y－b）/a＝y(tǒng)/a－b/a，由于b值通常為誤差引起，在a/b值大于100時(shí)，b/a值可以忽略不計(jì)，此時(shí)可以公式x＝y(tǒng)/a直接計(jì)算其含量。故RCF可以二者的斜率a的比直接計(jì)算，計(jì)算公式為fk/s＝ak/as，式中as為內(nèi)參物標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；ak為其他待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。根據(jù)表1中回歸方程，以275 nm波長(zhǎng)下黃芩苷為內(nèi)參物（1.000），306 nm波長(zhǎng)下的虎杖苷RCF為0.529；275 nm波長(zhǎng)下的漢黃芩苷、黃芩素的RCF分別為0.506、1.004；225 nm波長(zhǎng)下的穿心蓮內(nèi)酯RCF為0.831；254 nm波長(zhǎng)下的脫水穿心蓮內(nèi)酯RCF為1.087。

2.12 RCF重現(xiàn)性考察

考察流動(dòng)相各梯度點(diǎn)組分比例變化、流速變化、柱溫變化以及各成分檢測(cè)波長(zhǎng)變化時(shí)對(duì)RCF的影響。結(jié)果，流動(dòng)相各梯度點(diǎn)比例變化±5%，流速變化±10%，柱溫變化±5℃，各活性成分檢測(cè)波長(zhǎng)變化±2 nm時(shí)對(duì)各成分的RCF影響較小，RSD均在3.0%以內(nèi)。另外，本研究還考察了不同品牌HPLC儀及3種不同品牌色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18、Inertsil ODS-SPHPLC Column、Waters Sunfire C18（規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)RCF的影響，結(jié)果不同HPLC儀、不同色譜柱條件下虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯RCF的RSD依次為1.3%、1.4%、1.0%、0.9%、1.4%，RSD均小于2.0%。不同HPLC儀器及色譜柱對(duì)RCF的影響見(jiàn)表2。

表2 不同HPLC儀器及色譜柱對(duì)RCF的影響（n＝3）Tab 2 Effects of different HPLC instrument and chromatographic column on RCF（n＝3）

2.13 待測(cè)色譜峰的定位

色譜峰的準(zhǔn)確定位是QASM法應(yīng)用的關(guān)鍵，可采用保留時(shí)間差（指各待測(cè)成分與內(nèi)參物間保留時(shí)間的差值）或相對(duì)保留時(shí)間（指各待測(cè)成分與內(nèi)參物間保留時(shí)間的比值）等參數(shù)，并結(jié)合色譜圖整體特征，以及每個(gè)峰的紫外吸收特征來(lái)定位待測(cè)成分色譜峰[15]。本研究通過(guò)考察保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間兩種參數(shù)在不同品牌HPLC儀和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果，保留時(shí)間差的波動(dòng)較為明顯（RSD＞5%），相對(duì)保留時(shí)間的波動(dòng)相對(duì)較?。≧SD＜3.5%）。因此，采用相對(duì)保留時(shí)間法進(jìn)行待測(cè)成分色譜峰的定位。但是對(duì)于成分復(fù)雜的樣品，可選用定性用的對(duì)照品或“對(duì)照提取物”對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定位，此法峰定位準(zhǔn)確，受色譜條件及內(nèi)參物變化干擾小[16]。

2.14QASM與ESM結(jié)果比較

按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄虎杖苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的峰面積，分別采用ESM和QASM對(duì)5批復(fù)方黃芩片中6種活性成分含量進(jìn)行測(cè)定，并利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0對(duì)兩組含量結(jié)果進(jìn)行成組t檢驗(yàn)，驗(yàn)證QASM方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果，兩種方法測(cè)得6種活性成分含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同方法測(cè)定復(fù)方黃芩片中6種成分含量的結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Determination results of 6 components in Compound huangqin tablets by different methods（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動(dòng)相的選擇 在選擇流動(dòng)相時(shí)，筆者分別考察了甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液及乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液。結(jié)果，甲醇-0.05%磷酸作為流動(dòng)相時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯未被檢出；而采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液時(shí)，黃芩苷和虎杖苷色譜峰分離度未達(dá)到要求；當(dāng)采用乙腈-0.05%磷酸溶液流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，6種活性成分色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰分離完全，對(duì)稱因子在1.12～1.45之間，故以此作為流動(dòng)相。

3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，筆者在190～400 nm波長(zhǎng)段分別掃描6種活性成分混合對(duì)照品溶液，結(jié)果虎杖苷在306 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩苷在278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，漢黃芩苷在275 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩素在274 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，穿心蓮內(nèi)酯在225 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，脫水穿心蓮內(nèi)酯在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。參考文獻(xiàn)[2-8]，最終確定虎杖苷檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。本試驗(yàn)采用波長(zhǎng)切換法，在不同時(shí)段改變檢測(cè)波長(zhǎng)，保證了6種活性成分均在最佳吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)。

3.2 檢測(cè)方法的選擇

文獻(xiàn)[2-3]在測(cè)定復(fù)方黃芩片中有效成分含量時(shí)，采用獨(dú)立對(duì)照品用ESM測(cè)定其含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，均得到可靠結(jié)果。另HPLC定量方法中一般以回歸方程法計(jì)算結(jié)果最為準(zhǔn)確，但當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線a/b值大于100時(shí)，可采用外標(biāo)法一點(diǎn)法計(jì)算，ESM也是應(yīng)用最為普遍的定量方法[17]。故本研究選擇ESM測(cè)得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)來(lái)驗(yàn)證QASM的準(zhǔn)確性。黃芩苷為黃芩藥材中的主要成分之一，也是黃芩的特征性成分代表，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，容易取得，故選其作為內(nèi)參物，對(duì)虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行定量。

4 結(jié)論

本研究建立的QASM法可同時(shí)測(cè)定復(fù)方黃芩片中6種活性成分含量，以黃芩苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算虎杖苷、漢黃芩苷、黃芩素、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯與內(nèi)參物之間的RCF，并通過(guò)不同儀器、不同色譜柱、改變柱溫、改變檢測(cè)波長(zhǎng)及調(diào)整流動(dòng)相比例等因素考察QASM法的耐用性，結(jié)果改變上述條件對(duì)各成分RCF影響均很小。通過(guò)比較ESM法和QASM法對(duì)5批復(fù)方黃芩片含量測(cè)定的結(jié)果，得出兩種方法測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），驗(yàn)證了QASM法用于復(fù)方黃芩片中6種活性成分質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。

綜上，本研究建立的方法簡(jiǎn)單、有效、結(jié)果準(zhǔn)確、節(jié)約成本，可用于復(fù)方黃芩片中上述6種活性成分含量的同時(shí)測(cè)定。

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