UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中美沙酮、文拉法辛及其代謝物濃度與藥動(dòng)學(xué)研究Δ

李 好，陳連國(guó)，尤瑋瑋（溫州市人民醫(yī)院藥劑科，浙江溫州 325000）

鹽酸美沙酮（簡(jiǎn)稱美沙酮）是一類μ阿片受體激動(dòng)藥，具有鎮(zhèn)痛作用，被用于海洛因依賴脫毒和替代維持治療[1]。鹽酸美沙酮是目前發(fā)現(xiàn)的最為長(zhǎng)效的阿片類鎮(zhèn)痛藥物，具有血藥濃度較穩(wěn)定、成癮性小等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用越來(lái)越廣泛。但是，美沙酮也存在個(gè)體差異較大、與其他藥物容易發(fā)生相互作用等缺點(diǎn)[2]。2-亞乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡咯烷（EDDP）是美沙酮的活性代謝產(chǎn)物，美沙酮在體內(nèi)主要通過(guò)細(xì)胞色素P450（CYP450）中的CYP3A4和CYP2B6去甲基化，代謝生成EDDP。文拉法辛是抗抑郁藥物，屬于5-羥色胺和去甲腎上腺素的再攝取抑制劑（SNRI），是第二代非三環(huán)類抗抑郁藥物，其安全性及患者的耐受性明顯高于第一代抗抑郁藥，與第三代抗抑郁藥相當(dāng)。O-去甲文拉法辛為其有效的活性代謝產(chǎn)物之一，也具有抗抑郁的作用。使用美沙酮維持治療的患者，或者是使用美沙酮鎮(zhèn)痛治療的患者，往往會(huì)與抗抑郁藥、抗人類免疫缺陷病毒藥物等聯(lián)用[3-4]，以降低患者在脫毒期間的抑郁、焦慮程度，但這些藥物之間往往又會(huì)發(fā)生藥物相互作用。

目前測(cè)定美沙酮和文拉法辛及其代謝產(chǎn)物的方法分別有高效液相色譜（HPLC）法、熒光吸收光譜法、紫外吸收光譜法等[5]，但均為單獨(dú)測(cè)定，尚未見(jiàn)采用液-質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定血漿中美沙酮和文拉法辛濃度的文獻(xiàn)報(bào)道。故筆者建立同時(shí)測(cè)定美沙酮和文拉法辛及其代謝產(chǎn)物濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，并將其用于美沙酮和文拉法辛及其代謝物的含量檢測(cè)及藥動(dòng)學(xué)初步研究。

1 材料

1.1 儀器

XEVO TQD UPLC-MS/MS儀（美國(guó)Waters公司）；AE 200-S電子天平（浙江省科學(xué)器材進(jìn)出口有限責(zé)任公司）；QL-901渦旋混合器（江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）；Milli-Q Reference超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

鹽酸美沙酮對(duì)照品（美國(guó)Mallinckrodt公司，批號(hào)：P05077，純度：99.5%）；EDDP對(duì)照品（加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號(hào)：FN122109-01，純度：99.5%）；鹽酸文拉法辛對(duì)照品（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：98236-68-4，純度：98.0%）；O-去甲文拉法辛對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：93398-62-8，純度：98.0%）；地西泮（內(nèi)標(biāo)，南京蘇耀建科技有限公司，批號(hào)：171225-200903，純度：99.0%）；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康成年SD大鼠8只，♂，體質(zhì)量（257±23）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)條件下，動(dòng)物房室溫維持在24℃左右，濕度約為60%～70%。于實(shí)驗(yàn)前一晚8：00開(kāi)始禁食，禁食12 h，不禁水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 美沙酮貯備液 精密稱取美沙酮對(duì)照品2.50mg，用甲醇溶解于10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為250μg/mL美沙酮貯備液。

2.1.2 EDDP貯備液 精密稱取EDDP對(duì)照品10.00mg，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，甲醇定容，得質(zhì)量濃度為400μg/mL EDDP貯備液。

2.1.3 文拉法辛貯備液 精密稱取文拉法辛對(duì)照品10.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，得質(zhì)量濃度為400μg/mL文拉法辛貯備液。

2.1.4O-去甲文拉法辛貯備液 精密稱取O-去甲文拉法辛對(duì)照品5.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，得質(zhì)量濃度為200μg/mLO-去甲文拉法辛貯備液。

2.1.5 地西泮內(nèi)標(biāo)溶液 精確吸取2.5 mg/mL地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于25 mL量瓶中，甲醇定容，得質(zhì)量濃度為100μg/mL地西泮甲醇溶液；精確吸取100μg/mL地西泮甲醇溶液1 mL于100 mL量瓶中，甲醇定容，得質(zhì)量濃度為1μg/mL地西泮內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～0.5 min，35%A；0.5～1 min，35%～95%A；1～2 min，95%A；2～3 min，35%A）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI），正離子模式檢測(cè)。去溶劑化氣體：氮?dú)?；流速? 000 L/h；溫度：500℃；離子源溫度：150℃；碰撞氣體：氬氣；流速：0.1mL/min；毛細(xì)管電壓：1 kV。用于定量分析的離子對(duì)為：m/z310.4→265.4（美沙酮）、m/z278.2→234.1（EDDP）、m/z278.1→57.8（文拉法辛）、m/z263.9→57.9（O-去甲文拉法辛）、m/z285.1→193.1（地西泮）。

2.3 血漿樣品處理方法

將保存于－80℃冰箱的血漿取出，置于室溫下解凍。渦旋混勻，取100μL血樣于1.5 mL離心管中，加入

地西泮甲醇溶液（1μg/mL）40μL和乙腈200μL沉淀蛋白，渦旋混勻2 min，以離心半徑為10 cm，13 000 r/min離心10 min，取上清液100μL于0.5 mL離心管中，加入100μL超純水稀釋，渦旋混勻，進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別取大鼠空白血漿（不加內(nèi)標(biāo)）、空白血漿加美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛，以及大鼠給藥30 min后的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛和內(nèi)標(biāo)地西泮的出峰時(shí)間分別為1.66、1.58、1.37、1.19、1.79 min，且峰形良好，空白血漿對(duì)美沙酮及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)無(wú)明顯干擾，詳見(jiàn)圖1。美沙酮、文拉法辛及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。雖然兩者出峰時(shí)間相近，但是在其相應(yīng)的離子通道里，各物質(zhì)無(wú)相互干擾。

2.4.2 線性范圍與定量下限考察 準(zhǔn)確移取美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛標(biāo)準(zhǔn)貯備液200、125、100、200μL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，得到美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛質(zhì)量濃度為5μg/mL的混合工作液Ⅰ。將該混合工作液依次用甲醇稀釋，配成質(zhì)量濃度為10、20、100、200、500、1 000、2 000、5 000ng/mL的美沙酮、EDDP混合工作液Ⅱ；質(zhì)量濃度為8、16、80、160、400、800、1 600、4 000 ng/mL的文拉法辛、O-去甲文拉法辛混合工作液Ⅱ。準(zhǔn)確移取各混合工作液Ⅱ各5μL，依次加入到8份100μL的大鼠空白血漿中，得到美沙酮、EDDP終質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、25、50、100、250 ng/mL；文拉法辛、O-去甲文拉法辛終質(zhì)量濃度為0.4、1.8、4、8、20、40、80、200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以血漿中待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛回歸方程分別為y＝0.006 5x+0.012 3（r＝0.999 7），y＝0.013 8x+0.039 9（r＝0.999 2），y＝0.013 4x+0.023 1（r＝0.999 9）；y＝0.01x+0.006 5（r＝0.999 9），美沙酮、EDDP的線性范圍為0.5～250 ng/mL，文拉法辛、O-去甲文拉法辛為0.4～200 ng/mL，定量下限（信噪比＞10）分別為0.5、0.5、0.4、0.4 ng/mL。

2.4.3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度及基質(zhì)效應(yīng)考察 按相關(guān)要求進(jìn)行操作。結(jié)果，美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛的日內(nèi)（n＝6）、日間（n＝6）精密度的RSD均小于9.0%；方法回收率分別為94.20%～102.87%、90.93%～102.94%、92.95%～101.61%、90.33%～101.97%（RSD≤5.5%，n＝6）；提取回收率分別為85.90%～94.45%、85.97%～91.66%、87.97%～93.58%、88.53～94.54%（RSD≤5.9%，n＝6）；基質(zhì)效應(yīng)分別為95.96%～97.78%、92.33%～97.40%、95.28%～97.71%、95.33%～95.74%（RSD≤4.9%，n＝3）。穩(wěn)定性試驗(yàn)[室溫放置0、4、12 h，進(jìn)樣器（4 ℃）中放置0、4、12 h，－80℃凍存1周、2周和4周和室溫下反復(fù)凍融3次]峰面積的RSD＜10.0%（n＝3）。均符合相關(guān)要求。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatogram

圖2 正離子模式掃描質(zhì)譜圖Fig 2 Positive ion mode scanning mass spectra

2.7 藥動(dòng)學(xué)研究

8只SD大鼠分別灌胃鹽酸美沙酮6 mg/kg、鹽酸文拉法辛10 mg/kg（溶劑均為超純水），每組4只，給藥劑量按臨床常用劑量換算。分別于給藥前及給藥后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h經(jīng)尾靜脈取血0.3 mL置于1.5 mL EP管中，以離心半徑為10cm，13 000 r/min離心10 min，取血漿，－80℃冷凍保存。

取大鼠血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，按“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定。得到美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛的藥-時(shí)曲線，詳見(jiàn)圖3。采用DAS 3.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3 藥-時(shí)曲線圖Fig 3 Plasma concentration-time curves

表1 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝4）Tab 1Pharmacokinetic parameters（±s，n＝4）

表1 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝4）Tab 1Pharmacokinetic parameters（±s，n＝4）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-24 h，μg/（L·h）MRT0-24 h，h t1/2，h tmax，h CL/F，L/（h·kg）cmax，μg/L美沙酮201.95±51.14 3.55±0.21 1.42±1.02 1.12±0.43 31.93±15.15 52.21±5.42 EDDP 86.09±15.95 3.98±0.41 2.59±0.76 0.78±0.38 71.13±9.88 25.68±3.45文拉法辛75.38±23.95 1.44±0.21 0.63±0.08 0.60±0.22 142.10±46.42 52.64±2.29 O-去甲文拉法辛82.90±23.44 2.01±0.17 1.29±0.14 0.55±0.21 129.83±43.78 47.63±13.09

3 討論

美沙酮和抗抑郁藥有聯(lián)用指征[6]，美沙酮和文拉法辛聯(lián)合用藥可減少戒斷癥狀[7]。文拉法辛治療可能延長(zhǎng)或者降低抑郁伴發(fā)阿片類物質(zhì)依賴患者的復(fù)發(fā)時(shí)間或復(fù)發(fā)率，改善其抑郁癥狀[8]。文拉法辛能增強(qiáng)美沙酮的鎮(zhèn)痛作用，二者合用具有協(xié)同作用[9]。但二者協(xié)同的詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，理論上二者可聯(lián)用于臨床復(fù)合麻醉和癌痛的鎮(zhèn)痛治療，并可減少成癮性鎮(zhèn)痛藥的用量，消除患者緊張焦慮情況，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，但其實(shí)際的臨床療效還有待進(jìn)一步的觀察和驗(yàn)證[9]。

美沙酮除為μ阿片受體激動(dòng)藥外，也有一定的5-羥色胺再攝取抑制作用，故也有一定的抗抑郁作用[10]。文拉法辛是通過(guò)同時(shí)抑制5-羥色胺和去甲腎上腺素的再攝取而發(fā)揮作用。當(dāng)美沙酮與5-羥色胺再攝取抑制藥聯(lián)用時(shí)，若不及時(shí)調(diào)整劑量，可能會(huì)導(dǎo)致5-羥色胺綜合征的發(fā)生。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在合用美沙酮、環(huán)丙沙星和文拉法辛后，患者可發(fā)生5-羥色胺綜合征[11]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，個(gè)別患者在聯(lián)用美沙酮、舍曲林和文拉法辛后，亦發(fā)生了5-羥色胺綜合征[10]。美沙酮的心臟毒性是其嚴(yán)重不良反應(yīng)之一，包括QT間隙延長(zhǎng)、尖端扭轉(zhuǎn)型心律失常等[12]。美沙酮的代謝主要與CYP3A4、CYP2B6等有關(guān)[13]。當(dāng)這些藥物代謝酶的誘導(dǎo)劑或抑制劑與美沙酮聯(lián)用時(shí)，可使美沙酮的血藥濃度發(fā)生變化。特別是聯(lián)用抑制劑，可使美沙酮血藥濃度上升，可致QT間隙延長(zhǎng)和尖端扭轉(zhuǎn)型心律失常的發(fā)生率增加。還有些藥物，本身所引發(fā)的不良反應(yīng)也包括QT間隙延長(zhǎng)，如胺碘酮、紅霉素、氟哌啶醇、特非那定、文拉法辛等[14]。當(dāng)這些藥物與美沙酮聯(lián)用時(shí)，在QT間隙的延長(zhǎng)發(fā)生率增加的同時(shí)，延長(zhǎng)的時(shí)間也會(huì)增加，進(jìn)而導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)型心律失常的發(fā)生。當(dāng)美沙酮與其他藥物合用時(shí)，應(yīng)注意是否有藥效上的協(xié)同作用，或者是否有藥動(dòng)學(xué)上的相互作用發(fā)生，以免影響美沙酮的血藥濃度。

在前期試驗(yàn)中，筆者先以乙腈-水為流動(dòng)相，考察了二者多個(gè)體積比的分析效果，但峰形均拖尾嚴(yán)重。之后發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入0.1%的甲酸可以提高靈敏度和改善峰形[15]。由于文拉法辛為堿性物質(zhì)，梯度洗脫中可在流動(dòng)相的水相中加入酸，所以加入0.1%甲酸后，峰形得到改善，減少了拖尾現(xiàn)象，并且增加了檢測(cè)的靈敏度和精密度，提高了分離能力。因此本研究以乙腈和0.1%甲酸作為流動(dòng)相。另，本試驗(yàn)采用地西泮作為內(nèi)標(biāo)物。采用內(nèi)標(biāo)法可更進(jìn)一步減少檢測(cè)干擾和系統(tǒng)誤差。血漿樣品處理是方法學(xué)建立的重要步驟，本研究采用乙腈沉淀血漿蛋白的方法處理樣品，方法簡(jiǎn)單、用時(shí)較短，且萃取率高。

綜上所述，本研究建立的UPLC-MS/MS法可同時(shí)測(cè)定美沙酮與文拉法辛及其代謝產(chǎn)物的含量，且該法具有專屬性高、分離完全、檢測(cè)時(shí)間快的特點(diǎn)，可用于美沙酮與文拉法辛的血藥濃度檢測(cè)，以及為進(jìn)一步研究美沙酮與文拉法辛及其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)提供依據(jù)。

[1]MARIENFELD C，ROSENHECK RA.Psychiatric services and prescription fills among veterans with serious mental illness in methadone maintenance treatment[J].Dual Diagn J，2015，11（2）：128-135.

[2]PETER A，DEMARIA JR.Methadone drug interactions[J].Journal of Maint Addic，2008，2（3）：69-74.

[3]WANG M，MAO WW，ZHANG LL，et al.Methadone maintenance therapy and HIV counseling and testing are associated with lower frequency of risky behaviors among injection drug users in China[J].Subst Use Misuse，2015，50（1）：15-23.

[4]SCHREIBER S，BARAK Y，HOSTOVSKY A，et al.Interaction of different antidepressants with acute and chronic methadone in mice，and possible clinical implications[J].J Mol Neurosci，2014，52（4）：598-604.

[5]賈晶瑩，張夢(mèng)琪，桂雨舟，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定7種抗抑郁類和5種抗精神病類藥物的血藥濃度

[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2010，7（5）：272-275.

[6]PEDRELLI P，IOVIENO N，VITALI M，et al.Treatment of major depressive disorder and dysthymic disorder with antidepressants in patients with comorbid opiate use disorders enrolled in methadone maintenance therapy：a meta-analysis[J].J Clin Psychopharmacol，2011，31（5）：582-586.

[7]FADAEI-KENARSARY M，F(xiàn)ARBOOD Y，TAGHI SM，et al.Effects of venlafaxine&methadone alone and in combination with spontaneous morphine withdrawal syndrome&pain sensation in rats[J].Basic Clin Neurosci，2016，6（1）：21-28.

[8]張莉，石元洪，李毅.文拉法辛治療阿片類物質(zhì)依賴伴抑郁患者復(fù)發(fā)的影響[J].中國(guó)藥物依賴性雜志，2015，24（3）：193-196.

[9]何巧燕.文拉法辛對(duì)美沙酮鎮(zhèn)痛作用的影響[J].山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，15（1）：1-2.

[10]MARTINEZ TT，MARTINEZ DN.A case of serotonin syndrome associated with methadone overdose[J].Proc West Pharmacol Soc，2008，51：42-44.

[11]LEE J，F(xiàn)RANZ L，GOFORTH HW.Serotonin syndrome in a chronic-pain patient receiving concurrent methadone，ciprofloxacin，and venlafaxine[J].Psychosomatics，2009，50（6）：638-639.

[12]LUSETTI M，LICATA M，ENRICO S，et al.Therapeutic and recreational methadone cardiotoxicity[J].J Forensic Leg Med，2016.DOI：2016.01.016.Epub2016Jan25.

[13]CRETTOL S，DEGLON JJ，Besson J，et al.ABCB1 and cytochrome P450genotypes and phenotypes：influence on methadone plasma levels and response to treatment[J].Clin Pharmacol Ther，2006，80（6）：668-681.

[14]UCHIDA M，ANDREA ES，BIEDERMAN JH，et al.A systematic evaluation of the QTc interval and antidepressants in youth：an electronic health record study[J].J Dev Behav Pediatr，2015，36（6）：434-439.

[15]喬麗曼，王豪，樓旦.超高效液相-質(zhì)譜法檢測(cè)人血漿中格列美脲和氟西汀及其代謝產(chǎn)物[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2015，31（18）：1873-1876.