HPLC法同時測定余甘子中5種成分的含量及主成分、聚類分析Δ

李琦，裴河歡，李靜，羅亞虹（1.桂林市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西桂林541012；2.欽州市中醫(yī)醫(yī)院科研科，廣西欽州 535000；3.欽州市中醫(yī)藥研究所，廣西欽州 535000）

余甘子為大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.）的干燥成熟果實(shí)，異名油甘子、牛甘子、喉甘子、魚木果等，是一味傳統(tǒng)民族藥，主要分布于福建、廣東、廣西等地。其以果實(shí)入藥，主治血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛等癥[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，余甘子中富含的多元酚類化合物具有抗氧化作用，能減輕自由基對機(jī)體的損傷，緩解疲勞[3-4]。文獻(xiàn)[5-7]報(bào)道了同時測定余甘子中3～4種多元酚類化合物的含量。為提高余甘子質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定廣西余甘子中5種多元酚類化合物的含量，并對廣西12個采集地余甘子中所含5種多元酚類化合物的含量進(jìn)行主成分分析和聚類分析[8-14]，將復(fù)雜的多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)代表性的綜合指標(biāo)，從而識別藥材質(zhì)量的優(yōu)劣和產(chǎn)地的規(guī)律性，為余甘子藥材質(zhì)量控制和綜合評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260 InfinityⅡHPLC儀，包括G7115A二極管陣列寬波長范圍檢測器、G7129A自動進(jìn)樣器、G7111B四元梯度泵（美國Agilent公司）；XS205DU電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；101-1-BS-Ⅱ鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；DTA-42超聲波清洗機(jī)[鼎泰（湖北）生化科技設(shè)備制造有限公司]；Simplicity超純水系統(tǒng)（德國Merck Millipore公司）。

1.2 試劑

沒食子酸對照品（批號：110831-201605，純度：90.8%）、柯里拉京對照品（批號：111623-200301，純度：100%）、鞣花酸對照品（批號：111959-201602，純度：89.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；沒食子兒茶素對照品（批號：PRF7081801，純度：98%）、訶子聯(lián)苯酸對照品（批號：PRF8032222，純度：92%）均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

藥材來源見表1。所有樣品經(jīng)挑選，為飽滿、質(zhì)實(shí)、無蟲霉者。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉壽養(yǎng)副教授鑒定均為大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.）的新鮮成熟果實(shí)。將挑選后的樣品用超純水洗凈，干燥，去核，粉碎制成直徑為0.5～0.8 cm的粗顆粒，充分混合均勻，再按四分法取樣，每份約200 g，備用。

生品：取余甘子粗顆粒，粉碎，過四號篩，混合均勻，備用。

表1 藥材來源Tab 1 Sources of P.emblica

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，4%A；10～11 min，4%→6%A；11～25 min，6%→13%A；25～35 min，13%→14%A；35～36 min，14%→15%A；36～50 min，15%→17%A；50～60 min，17%→4%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 ①精密稱取沒食子酸對照品10.98 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為199.4 μg/mL的對照品貯備液A。精密吸取對照品貯備液A 5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為39.88 μg/mL的對照品貯備液B。②精密稱取沒食子兒茶素對照品10.19 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為19.97 μg/mL的對照品貯備液C。精密吸取對照品貯備液C 5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.997 μg/mL的對照品貯備液D。③精密稱取柯里拉京對照品15.11mg，置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為151.1 μg/mL的對照品貯備液E。④精密稱取訶子聯(lián)苯酸對照品20.04 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為368.7 μg/mL的對照品貯備液F。⑤精密稱取鞣花酸對照品16.55 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為295.6 μg/mL的對照品貯備液G。精密吸取對照品貯備液G 5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為29.56 μg/mL的對照品貯備液H。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液B、D、E、F、H各1 mL，置于同一10 mL棕色量瓶中，甲醇定容，制成含沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸質(zhì)量濃度分別為3.988、0.199 7、15.11、36.87、2.956 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取“1.3”項(xiàng)下生品約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：900 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液和“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號S5）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測成分間與雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)以沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸峰計(jì)均＞3 000，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液A 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，對照品貯備液C 0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL，對照品貯備液E 1.5、3.0、6.0、12.0、15.0 mL，對照品貯備液F 2.0、4.0、8.0、10.0、12.0 mL，對照品貯備液G 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分別置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。線性關(guān)系考察結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 2 Results of linear range investigation

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限；當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限。結(jié)果，沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸和鞣花酸的檢測限分別為0.025 6、0.027 1、0.052 9、0.186 7、0.133 1 μg/mL，定量限分別為0.085 1、0.089 3、0.170 6、0.615 2、0.441 9 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣測定3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸峰面積的日內(nèi)精密度RSD分別為0.21%、0.88%、0.14%、0.20%、0.64%（n＝6），日間精密度RSD分別為0.26%、1.42%、0.25%、0.24%、0.67%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號S5）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.45%、0.63%、0.27%、0.57%、0.60%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取編號S5的生品約0.1 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并扣除生品（編號S5）含水量后，再計(jì)算含量。結(jié)果，沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸含量平均值分別為2.314 4、0.109 1、6.138 6、12.394 5、1.938 1 mg/g，RSD 分別為 0.76%、1.38%、0.55%、0.84%、1.02%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的“1.3”項(xiàng)下生品（編號S5）約0.05 g，共6份，分別加入一定體積的“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并扣除生品（編號S5）含水量計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

各取12批生品約0.1 g，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并扣除12批生品中含水量后，再計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，12批生品中，訶子聯(lián)苯酸含量差異最小，其余4種成分含量差異較大，其中沒食子酸含量高低相差近5倍，表明廣西不同產(chǎn)地余甘子藥材質(zhì)量存在一定差異，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

2.11 主成分分析

主成分分析具有降維思想，可以把多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)，使這些少數(shù)的綜合指標(biāo)又能盡量多地反映原來較多指標(biāo)所反映的信息。通過SPSS 25.0軟件對12批樣品含量測定結(jié)果進(jìn)行主成分分析。結(jié)果，特征值＞0.95的前3個主成分累積方差貢獻(xiàn)率為85.753%，能基本說明樣本大部分信息，見表5、表6。主成分1貢獻(xiàn)度最顯著，其中沒食子酸、沒食子兒茶素、鞣花酸載荷較高，說明主成分1主要反映了這3種成分指標(biāo)的信息；主成分2主要體現(xiàn)訶子聯(lián)苯酸的信息；對主成分3貢獻(xiàn)最大的是柯里拉京。根據(jù)各主成分得分進(jìn)行綜合評價，其綜合得分（F）＝0.513 1×F1+0.265 4×F2+0.221 5×F3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所收集的樣品中編號S9的綜合得分（F）最高，藥材質(zhì)量較好，結(jié)果見表7。

表5 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab 5 Characteristic value and variance contribution rate of principal component

2.12 聚類分析

為了考察廣西余甘子中5種成分的含量差異與產(chǎn)地之間的相互關(guān)系，通過SPSS 25.0軟件和歐式距離系數(shù)對12批樣品進(jìn)行聚類分析。當(dāng)15＜閾值＜25時，可分為兩類，第Ⅰ類：S11；第Ⅱ類：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12。結(jié)合主成分得分排序，可知S11質(zhì)量稍差。當(dāng)5＜閾值＜9時，可將第Ⅱ類細(xì)分為四類，第1類：S4、S9、S1，在表7評價排序中分別為第4、1、3位；第2類：S2、S10，在表7評價排序中分別為第5、2位，第1類和第2類又可聚成一類，說明這兩類質(zhì)量較好，可見排第1、2位廣西玉林市容縣的質(zhì)量最好。第3、4類中S12、S3、S8、S5、S6、S7在表7評價排序中為第6～12位（第9位除外），說明這兩類質(zhì)量稍差，結(jié)果見圖2。

表6 主成分矩陣Tab 6 Principal component matrix

表7 主成分得分綜合評價結(jié)果Tab 7 Results of comprehensive principal component evaluation

圖2 聚類分析樹狀圖Fig 2 Cluster analysis tree diagram

3 討論

筆者在預(yù)試驗(yàn)中考察了用25%甲醇、50%甲醇、甲醇對余甘子的超聲提取率，結(jié)果其提取率分別為11%、19%、19%，結(jié)果顯示50%甲醇和甲醇的超聲提取率較高。因鞣花酸具水難溶性[15]，在低濃度甲醇中溶解性能較差，而高濃度甲醇提取出的雜質(zhì)成分較多，檢測易造成干擾，故采用50%甲醇作為提取溶劑。預(yù)試驗(yàn)二極管陣列檢測器圖譜分析結(jié)果顯示，沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸和鞣花酸分別在270、220、280、254 nm波長處有最大吸收。在220 nm波長處基線平穩(wěn)，色譜峰相互之間分離效果較好，且各峰形較好，故選擇檢測波長為220 nm。當(dāng)有機(jī)相選用甲醇時，流動相梯度洗脫過程中基線波動較大，而當(dāng)乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，基線平穩(wěn)，各色譜峰分離效果也較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。

在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，多元酚類化合物是氫或電子供體，因具有酚類游離基中間體的共振非定域作用和沒有適合分子氧進(jìn)攻的位置，所以比較穩(wěn)定，不會引起新的游離基或者因鏈反應(yīng)而被迅速氧化[16]，因此具有抗氧化作用。另據(jù)文獻(xiàn)[17]報(bào)道，多元酚類化合物在余甘子中含量高達(dá)12.9%，而沒食子酸是余甘子中多元酚類化合物的主要成分。這與表6中沒食子酸、沒食子兒茶素在主成分1中載荷較高相一致。由表4可知，沒食子酸含量在廣西不同產(chǎn)地之間差異較大，梧州市藤縣和平鎮(zhèn)的沒食子酸含量為9.478 7 mg/g，而欽州市靈山縣平南鎮(zhèn)的沒食子酸含量為2.096 8 mg/g，相差近5倍，說明產(chǎn)地不同，化學(xué)成分的含量存在較大差異，為確保余甘子藥材質(zhì)量，應(yīng)相對固定產(chǎn)地采收。經(jīng)主成分分析，表7中F值越大說明余甘子中成分綜合含量越高，質(zhì)量越好，由此可知S9質(zhì)量較好。經(jīng)聚類分析，廣西不同產(chǎn)地余甘子質(zhì)量有差異?；景吹赜蛐跃鄢?類，其中1類又可細(xì)分為四小類：玉林市容縣、梧州市藤縣等地區(qū)分別聚成質(zhì)量較好的兩小類，崇左市龍州縣、欽州市靈山縣及百色市田林縣等地區(qū)分別聚成質(zhì)量稍差的另兩小類，該分類符合地域分布特征。但梧州市藤縣個別地區(qū)與崇左市龍州縣地區(qū)聚成一類，這也說明除不同分布區(qū)地理和氣候因子影響外[18]，造成同一分布區(qū)質(zhì)量差異還可能與當(dāng)?shù)氐姆N植栽培條件等因素有關(guān)。

綜上，本研究建立的方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于余甘子中沒食子酸、沒食子兒茶素、柯里拉京、訶子聯(lián)苯酸、鞣花酸含量的同時測定。另外，在同時測定余甘子中5種成分含量的基礎(chǔ)上，結(jié)合主成分分析和聚類分析，提示廣西不同產(chǎn)地余甘子質(zhì)量有差異。

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