高效液相色譜法同時檢測荔枝果肉中甲基硫菌靈及其代謝物殘留量

王思威 劉艷萍 王瀟楠 徐能莉 孫海濱

摘要?[目的]建立甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉中的高效液相色譜（HPLC）檢測分析方法。[方法]樣品采用甲酸-乙腈作為提取溶劑、乙二胺N-丙基硅烷吸附劑（PSA）進行凈化，高效液相色譜檢測分析荔枝果肉基質中的甲基硫菌靈和多菌靈殘留量。[結果]甲基硫菌靈和多菌靈在為0.01～1.00 mg/kg添加水平下的添加回收率分別為78.9%～97.6%、79.8%～94.6%，相對標準偏差分別為2.08%～3.95%、3.04%～5.27%;最低檢出量均為0.1 ng，最小檢出濃度均為0.01 mg/kg。[結論]該前處理方法簡便、有機溶劑用量少，準確度、精密度等均符合農(nóng)藥殘留檢測分析要求。

關鍵詞?甲基硫菌靈;多菌靈;荔枝果肉;高效液相色譜法;代謝物;殘留量

中圖分類號?TS207.5+3文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0174-03

甲基硫菌靈（thiophanatemethyl）是具有高效低毒的廣譜性內吸殺菌劑，具有保護和治療作用，廣泛用于糧食、棉花、蔬菜、果樹等多種作物上的病害防治，甲基硫菌靈在作物和土壤中使用后易轉化為多菌靈[1-3]，我國規(guī)定甲基硫菌靈殘留定義為甲基硫菌靈和多菌靈之和，以多菌靈表示。多菌靈（carbendazim）屬于廣譜低毒苯并咪唑類殺菌劑，廣泛用于大田作物、蔬菜、果樹和經(jīng)濟作物的子囊菌亞門、擔子菌亞門和半知菌亞門的許多病害防治。GB 2763—2016（食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量）中甲基硫菌靈僅在蘋果、梨、葡萄和西瓜等4種水果上制定了最大殘留限量標準，暫無荔枝。因此，通過建立甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉中的分析方法，為其后續(xù)在作物上的殘留量測定提供方法指導。

目前，有關甲基硫菌靈和多菌靈的分析方法報道主要有采用HPLC和HPLC-MS方法測定其在番茄、柑橘、黃瓜、芝麻等作物上的殘留[4-15]，而荔枝果肉中的分析方法鮮見報道。筆者通過高效液相色譜技術建立了甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉中的殘留量分析方法，為監(jiān)測市場荔枝產(chǎn)品中2種環(huán)境污染物提供了分析方法參考。

1?材料與方法

1.1?儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）;勻漿機（IKA-T18型，德國制造）;離心機（GTR-22-1型高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司）;氮吹儀（OA-SYS，美國Organomation公司）。

1.2?試劑

甲基硫菌靈和多菌靈標準品，純度分別為99.5%和98.6%，均購自美國Chem Service公司;甲醇、乙腈（色譜純）;甲酸（色譜純，美國Fluka公司）;無水MgSO4和NaCl（國藥集團化學試劑有限公司）;乙二胺N-丙基硅烷吸附劑（PSA）（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3?樣品前處理

1.3.1?樣品預處理。

1.3.1.1?荔枝樣本采集。隨機在試驗小區(qū)荔枝樹的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位用剪刀采集不少于2 kg生長正常、無病害、未噴施過甲基硫菌靈和多菌靈的荔枝空白個體，裝入樣本袋中，貼好標簽，盡快送往實驗室。

1.3.1.2?荔枝果肉樣品。所有器具沖洗后，取田間荔枝殘留樣本剝去荔枝皮，取出果肉和果核，果核棄去，將果肉切碎混勻，用四分法縮分，分取250 g 樣品2份，裝入樣品容器中，貼好標簽，并貯存在-20 ℃低溫冰箱中待用。

1.3.2?添加樣品及檢測。

稱取20.0 g已制備好荔枝果肉樣品于100 mL離心管中，分別從1、10、100 mg/L甲基硫菌靈和多菌靈混合標準溶液中吸取0.2 mL添加到已稱好的果肉樣品中，靜置1 h，再加入40 mL 0.1%甲酸-乙腈提取，勻漿2 min，加入7 g NaCl，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min。取上層乙腈提取液20 mL（相當于10 g樣品量）濃縮約50 μL，用乙腈定容至2 mL，待凈化。

將2 mL乙腈提取液轉移至加有150 mg無水MgSO4、50 mg PSA的離心管中，用手劇烈振蕩，渦旋10 s，10 000 r/min離心2 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，待HPLC測定。

1.4?色譜條件

島津LC-20A配二極管陣列紫外檢測器，色譜柱為Wondasil C18-WR（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為水/甲醇/乙腈/0.1%甲酸水溶液（體積比36.4∶3.0∶60.0∶0.6），流速為0.5 mL/min，波長272 nm，進樣量為30 μL。

1.5?標準曲線制作

準確稱取甲基硫菌靈和多菌靈標準品，用乙腈配成1 000 mg/L的標準溶液，采用系列稀釋法稀釋至所需的質量濃度0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L，以峰面積（y）對進樣量（x）做圖，建立甲基硫菌靈和多菌靈的標準曲線方程。

1.6?添加回收率測定

取荔枝果肉空白樣品20.0 g，添加水平為0.01～1.00 mg/kg，重復5次，按照上述提取凈化方法處理之后，用液相色譜儀器進行測定，計算添加回收率。

2?結果與分析

2.1?儀器條件優(yōu)化

2.1.1?流動相選擇。

比較了Wondasil C18-WR、Thermo batabasic-18和依利特Hypersil ODS2等3種反相色譜柱對甲基硫菌靈和多菌靈2種化合物峰型、保留時間、響應強度等的影響。結果顯示，采用Thermo batabasic-18時，甲基硫菌靈色譜峰有分叉，不對稱，且不能回歸基線，多菌靈基線漂移;依利特Hypersil ODS2色譜柱，甲基硫菌靈峰型不對稱，基線漂移，多菌靈響應值減弱;應用Wondasil C18-WR色譜柱，2種目標農(nóng)藥的峰型對稱，基線穩(wěn)定，響應值高，能達到完全分離。

2.1.2?流速選擇。

采用Wondasil C18-WR色譜柱，分別設置流速為0.4和0.5 mL/min，比較甲基硫菌靈和多菌靈的保留時間、峰型等。結果發(fā)現(xiàn)，當流速為0.4 mL/min，甲基硫菌靈的峰型不對稱，靈敏度降低;流速為0.5 mL/min，峰型對稱，基線平穩(wěn)，分離度較好，響應強度高。

2.2?提取劑選擇

分別比較了丙酮和乙腈2種常用有機溶劑對荔枝果肉基質中甲基硫菌靈和多菌靈的提取效率，結果顯示，當丙酮作為提取溶劑時，可將基質中的糖類等雜質與目標農(nóng)藥一并提取，樣品黏稠，加大了凈化難度，并可導致色譜柱、檢測器的污染，此外，丙酮易溶于水，不易達到明顯分層效果，不利于后續(xù)凈化;乙腈中加入少量甲酸作為提取溶劑，可顯著提高甲基硫菌靈和多菌靈在基質中的提取效率，且提取液較清澈，兩相界面分層效果明顯，適于作為荔枝果肉基質的提取劑。

2.3?凈化條件優(yōu)化

無水MgSO4主要作用是用于除去樣品中的水分，確保目標分析物易被有機溶劑完全提取;PSA作為弱陰離子交換填料，能夠有效去除基質中糖類、脂肪酸等物質。荔枝果肉中含有大量糖分、維生素、氨基酸等物質，采用PSA能夠有效去除雜質干擾，確保目標分析物峰型對稱、無拖尾。

2.4?線性范圍

以甲基硫菌靈和多菌靈的濃度為橫坐標，與其對應的峰面積為縱坐標，在濃度為0.01～2.00 mg/L范圍內2種目標農(nóng)藥的濃度與其響應峰面積呈現(xiàn)良好的正相關性，線性方程分別為y=231 530x-681.99（r=1.000 0）、y=136 409x+2 419.6（r=0.999 9）。

2.5?準確度、精密度和靈敏度

從表1可以看出，在添加質量濃度為0.01～1.00 mg/kg時，荔枝果肉中甲基硫菌靈的添加回收率為78.9%～97.6%，相對標準偏差為2.08%～3.95%;多菌靈添加回收率為79.8%～94.6%，相對標準偏差為3.04%～5.27%。2種農(nóng)藥的準確度、精密度和重現(xiàn)性均符合回收率在70%～120%、相對標準偏差低于20%的農(nóng)藥殘留分析要求。

在上述前處理分析方法和HPLC儀器條件下，甲基硫菌靈最低檢出量為0.1 ng，最小檢出濃度為0.01 mg/kg;多菌靈的最低檢出量為0.1 ng，最小檢出濃度為0.01 mg/kg。

3?結論

該研究采用QuEChERS方法結合高效液相色譜技術，建立了甲基硫菌靈和多菌靈2種農(nóng)藥在荔枝果肉基質中殘留量的前處理方法和液相檢測分析條件，并討論儀器條件、提取溶劑等相關參數(shù)。結果表明，該方法操作簡便、快速、有機溶劑用量少，能夠滿足甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉基質中的殘留檢測分析要求。

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