草莓酒自然發(fā)酵過程中的真菌群落分析

張 源，孫曉璐，蘭 偉，張新紅，劉文福，王士華

（1.阜陽師范學院 生物與食品工程學院，安徽 阜陽236037；2.阜陽職業(yè)技術學院，安徽 阜陽 236031；3.阜陽市鴻福農業(yè)科技股份有限公司，安徽 阜陽 236127；4.阜陽市潁泉區(qū)農產品質量安全檢驗檢測站，安徽 阜陽 236000）

果酒的發(fā)酵本質上是以酵母菌為主導的微生物代謝過程。早期的研究認為，非釀酒酵母屬酵母耐酒精能力弱，發(fā)酵力弱，產酒精能力低，產生大量的醋酸，因此一直被認為是葡萄酒釀造的有害菌種。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，某些非釀酒酵母在發(fā)酵過程中可產生一些高級醇、低級脂肪酸和酯類等芳香化合物，使得果酒的氣味芬芳，酒體典型性更加突出[1-2]。此外，葡萄表面自然附著的某些霉菌，如：貴腐霉菌（Botrytis cinerea）能賦予葡萄酒更濃郁的果香、花香和烘烤香氣，而白粉菌（Erysiphe necator），則會減少香草類化合物的含量，令葡萄酒索然無味[3]。在一些傳統(tǒng)的葡萄酒產區(qū)，仍然保留了自然發(fā)酵的生產方式，且利用野生菌種自然發(fā)酵生產的葡萄酒無論在結構、復雜感、香氣、地域特色等方面往往均優(yōu)于純種釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒[4]。這顯示出自然發(fā)酵在果酒釀造中的獨特價值。針對草莓酒的初步研究也發(fā)現(xiàn)，單一酵母菌種發(fā)酵的草莓酒酒質純凈，但存在口感淡薄的品質缺陷，而自然發(fā)酵的草莓酒香氣更豐富、典型，還具有更加復雜的有機酸組成，口感更醇厚，但口感偏酸[5]。這表明，草莓酒的多菌種自然發(fā)酵對果酒品質既有積極影響，也有消極的一面。因此，如何利用自然發(fā)酵的優(yōu)勢，彌補或改善自然發(fā)酵與單一酵母菌種發(fā)酵的缺陷，尚需深入研究。為此，闡明草莓酒自然發(fā)酵過程中的微生物群落組成、結構及演替變化規(guī)律，分析其與酒體特征之間的聯(lián)系，是了解自然發(fā)酵草莓酒酒體特征形成機制的基礎。由于目前尚無相關研究的系統(tǒng)報道，本研究利用高通量測序技術，分析了草莓酒自然發(fā)酵過程中的真菌群落結構，并探討了主要優(yōu)勢菌群及其與草莓酒品質的關系，以期為后續(xù)研究提供理論依據(jù)與參考。

1　材料與方法

1.1　材料

草莓品種為‘甜查理’，于2017年4月24日采收于阜陽市潁泉區(qū)聞集鎮(zhèn)文福草莓種植專業(yè)合作社。該批草莓于2016年8月15日定植，2016年10月20日扣棚，進行保護地栽培，直至2017年5月。白砂糖（市售）；滅菌10 L發(fā)酵罐；控溫培養(yǎng)箱；無菌取樣管（20 mL）；移液槍（10 mL）。

1.2　發(fā)酵方法

大田采摘的新鮮草莓運輸至阜陽市鴻福農業(yè)科技股份有限公司，經破碎機（合肥大漢釀酒設備有限公司）破碎打漿，皮渣分離后，裝入無菌發(fā)酵罐。轉移至實驗室后，加入鮮重20%的白砂糖，25℃條件下自然發(fā)酵。在超凈工作臺內分別采集發(fā)酵初期（第2天）、發(fā)酵中期（第6天）、發(fā)酵末期（第10天）的發(fā)酵樣品。樣品設兩個平行（初期B011、B012；中期 B021、B022；末期 B031、B032），所取樣品-20℃凍藏保存，后送往上海派森諾生物科技股份有限公司武漢分公司進行測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.3　高通量測序及分析

原始數(shù)據(jù)處理：使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序。運用QIIME軟件（v1.8.0）識別疑問序列，檢查并剔除嵌合體序列。

調用UCLUST序列比對工具，對前述獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分。隨后，根據(jù)每個OTU在每個樣本中所包含的序列數(shù)，構建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件（即OTU table）。

對于每個OTU的代表序列，在QIIME軟件中使用默認參數(shù)，通過將OTU代表序列與真菌的ITS序列的數(shù)據(jù)庫（UNITE數(shù)據(jù)庫，Release 5.0）的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應的分類學信息。

而后根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結果，獲取每個樣本在各分類水平的具體組成，分析不同發(fā)酵時期樣本的真菌群落組成結構及群落組成的動態(tài)變化。并在屬的分類水平上分析可能對草莓酒品質產生重要影響的關鍵真菌類群。

2　結果與分析

2.1　高通量測序結果

對稀釋曲線如圖1的分析顯示，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明測序結果已足夠反映當前樣本所包含的多樣性，繼續(xù)增加測序深度已無法檢測到大量的尚未發(fā)現(xiàn)的新OTU。基本可以反映草莓酒發(fā)酵過程中的絕大多數(shù)真菌信息。

2.2　草莓酒自然發(fā)酵過程中的真菌群落分析

2.2.1　門、綱、目、科分類水平的對比分析

利用高通量測序技術，在草莓酒自然發(fā)酵醪液中共檢測到7個菌門，包含29個綱，70個目，127個科，195個屬的真菌。但仍有較多類群未能鑒定（unidentified）或未能確定（Incertae sedis）到門、綱、目、科分類水平。圖2列出了綱、目、科分類水平上，平均豐度（發(fā)酵初、中、末期相對豐度平均值）高于1%的主要真菌類群。從圖2可以看出，隨著發(fā)酵的進行，菌群結構呈現(xiàn)單一化趨勢。

圖1　稀釋曲線

在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）是主要的真菌類群，在發(fā)酵過程中它們占到整個菌群的96.6%～100%，如圖2(a)。

綱與目分類水平上的菌群結構相似,見圖2(b)和(c)，但發(fā)酵初、中、末期的群落結構存在差異。

圖2　門、綱、目、科分類水平的真菌菌群落結構

在科的分類水平上，如圖2(d)，酵母菌科（Saccharomycetaceae）在發(fā)酵初、中期的菌群豐度極低（初期0.0%、中期0.2%～0.4%），表明酵母目中其它非釀酒酵母是草莓酒初、中期發(fā)酵的主要動力。但至發(fā)酵末期，除鎖擲酵母目地位未定科（Incertae sedis）相對豐度無明顯變化外，其他分類類群相對豐度均大幅降低，酵母菌科（Saccharomycetaceae）成為絕對優(yōu)勢菌群（82.1%～84.2%），表明釀酒酵母是中后期發(fā)酵的主要動力。

2.2.2　屬分類水平的菌群結構及發(fā)酵過程中的對比分析

表1列出了菌群中平均豐度大于0.5%的優(yōu)勢屬。可以看出，發(fā)酵初期，Pilidium（20.2%～24.5%）、子囊菌門未確定屬（unidentified）（22.5%～26.1%）是主要的優(yōu)勢屬，但隨著發(fā)酵的進行，其相對豐度迅速下降至1%以下。而葡萄孢霉屬（Botrytis）、假絲酵母屬（Candida）隨著發(fā)酵的進行，豐度逐漸升高，成為發(fā)酵中期的優(yōu)勢屬（37.2%～43.8%、13.8%～15.5%），但發(fā)酵末期，相對豐度又迅速降低至1%以下，而酵母菌屬（Saccharomyces）（高通量測序鑒定為Saccharomyces cerevisiae）（82.1%～84.2%）成為發(fā)酵末期的絕對優(yōu)勢菌群。

如表1所示，酵母目中豐度較高的有5個屬，即：酵母菌屬（Saccharomyces）、假絲酵母屬、未確定屬（f__Dipodascaceae；g__unidentified）、畢赤酵母屬（Pichia）、亞羅酵母屬（Yarrowia）。從它們發(fā)酵過程中相對豐度的變化可以看出，假絲酵母屬、未確定屬（f__Dipodascaceae；g__unidentified）、畢赤酵母屬、亞羅酵母屬是草莓酒初期發(fā)酵的主要動力。此外，發(fā)酵初期豐度較高的非釀酒酵母還有擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、鎖擲酵母目（Sporidiobolales）未知屬（unidentified）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、布勒擲孢酵母屬（Bullera），其相對豐度的變化也顯示出發(fā)酵過程中非釀酒酵母與釀酒酵母之間明顯的群落演替現(xiàn)象。

表1　屬分類水平上的主要優(yōu)勢菌群及其結構

2.2.3　發(fā)酵初、中、末期屬水平的分類學組成差異分析

由于菌群相對豐度無法準確反映不同發(fā)酵階段的菌群差異，為進一步分析發(fā)酵初、中、末期的菌群差異，使用Mothur軟件，調用Metastats[6]的統(tǒng)計學算法，對屬水平的各個分類單元在發(fā)酵初、中、末期之間的序列量（即絕對豐度）差異進行兩兩比較檢驗。結果顯示，發(fā)酵中期(B02)與初期（B01）、發(fā)酵末期（B03）與初期（B01）、發(fā)酵末期（B03）與中期（B02）分別有 14個屬、20個屬、6個屬的序列量存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，酵母菌屬發(fā)酵中期與初期的絕對豐度無顯著差異，但發(fā)酵末期與中期、末期與初期差異顯著，表明酵母菌屬在發(fā)酵中期至末期存在顯著的菌群增殖。葡萄孢霉屬與假絲酵母屬在發(fā)酵初、中、末期絕對豐度均有顯著差異，表明它們在發(fā)酵初期至中期存在顯著的菌群增殖，但中期至末期存在顯著的菌群衰亡。Pilidium在發(fā)酵中期與初期、末期與初期的絕對豐度存在顯著差異，表明其在發(fā)酵過程中存在顯著的菌群衰亡。畢赤酵母屬絕對豐度在中期與初期、末期與中期存在顯著性差異，表明其在發(fā)酵初期至中期存在顯著菌群增殖，但中期至末期發(fā)生顯著菌群衰亡，而隱球酵母屬隨著發(fā)酵的進行，菌群發(fā)生持續(xù)衰亡。

3　討論

3.1　草莓酒自然發(fā)酵的真菌群落分析

利用高通量測序技術，本研究分析了2017年4月底草莓酒生產季節(jié)中，自然發(fā)酵過程中的真菌群落組成。結果顯示，草莓酒自然發(fā)酵醪液中的真菌多樣性較高（共計7個菌門，29個綱，70個目，127個科，195個屬），但隨著發(fā)酵的進行，群落內的物種數(shù)逐漸減少，群落結構趨于單一，表明自然發(fā)酵過程抑制了大多數(shù)真菌的生長繁殖。

在門分類水平，子囊菌門、擔子菌門、結合菌門是草莓酒自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群，這與葡萄酒的研究結果一致[7-8]。但在屬分類水平，Pilidium（20.2%～24.5%）、子囊菌門未確定屬（unidentified）（22.5%～26.1%）、葡萄孢霉屬（8.4%～15.1%）是草莓酒發(fā)酵初期主要的優(yōu)勢菌群，這與葡萄酒存在較大差異[8]。

研究顯示，與葡萄酒釀造有關的酵母大約有20個屬[9]，包括尖端酵母（Hanseniaspora/Kloeckera）、紅酵母（Rhodotorula）、假絲酵母等，其中，尖端酵母最豐富[10]。但本研究顯示，發(fā)酵初期草莓酒中尖端酵母豐度極低，而以假絲酵母為主，這與葡萄酒也存在很大差異。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期釀酒酵母的豐度很低（0.0%，即不足0.1%），且草莓酒發(fā)酵過程中非釀酒酵母與釀酒酵母的群落演替發(fā)生在第6天以后，相較于葡萄酒的自然發(fā)酵[7-8]是一個相對緩慢的過程，這很可能與其初期極低的數(shù)量基數(shù)及發(fā)酵液較高起始糖分的抑制有關。因此，非釀酒酵母對草莓酒的風味形成可能發(fā)揮著更為重要的作用。

3.2　草莓酒自然發(fā)酵過程中的菌群動態(tài)及其與果酒品質的關系

由于發(fā)酵初期的菌群結構基本代表了草莓果實表面自然附著的真菌類群，它們主要通過后期生長過程中的生理代謝底物及產物對酒體品質產生影響。菌群動態(tài)變化直觀反映了其在發(fā)酵過程中的生存與生理代謝狀態(tài)，因此，可以很好的指示其與酒體品質之間的聯(lián)系。

本研究顯示，盡管Pilidium與未確定屬（unidentified）是發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌群，但隨著發(fā)酵的進行，它們發(fā)生了快速的菌群衰亡，表明其難以適應發(fā)酵初期較高的含糖量、逐漸升高的酒精度或厭氧環(huán)境而迅速消亡，因此，它們對草莓酒的風味可能影響甚微。

葡萄孢霉屬是草莓酒發(fā)酵中的主要優(yōu)勢菌群（高通量測序鑒定為Botrytis carolinina），其在發(fā)酵中期至末期發(fā)生顯著的菌群衰亡，可能是發(fā)酵末期的厭氧環(huán)境及高酒精度對其產生了強烈抑制作用。但由于其在發(fā)酵初期至中期存在顯著的菌群增殖，其代謝產物必然會對酒體產生影響。葡萄孢霉屬中研究較多的是Botrytis cinerea，其感染葡萄果實后，會導致糖分的濃縮，從而賦予發(fā)酵醪液較高的起始糖度，可以釀造風味獨特的貴腐葡萄酒[11]。對受到感染的葡萄酒發(fā)酵醪液中微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，菌群中的微弱發(fā)酵酵母（如：Kloeckera、Candida）與醋酸菌顯著高于未被感染的葡萄酒發(fā)酵醪液[12-13]。在本研究中，草莓酒發(fā)酵醪液中的葡萄孢霉并非Botrytis cinerea，而是一種在黑莓與草莓中新發(fā)現(xiàn)的灰霉菌[14-15]。由于目前對該菌研究很少，其對草莓酒品質的影響尚不清楚。但本研究中較高豐度的假絲酵母菌及自然發(fā)酵草莓酒中較高的醋酸含量[5]顯示出Botrytis與微弱發(fā)酵酵母及醋酸菌之間可能存在協(xié)同關系。

假絲酵母是草莓酒發(fā)酵中的另一個優(yōu)勢菌群。其在發(fā)酵中期至末期存在顯著的菌群衰亡，可能與其是一種好氧型酵母有關。但由于其在發(fā)酵初期至中期存在顯著的菌群增殖，與草莓酒的品質也存在密切關聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，該類非釀酒酵母與釀酒酵母進行順序或混合發(fā)酵均顯示出高產甘油或產酯增香的效果[16-21]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，假絲酵母還能產生大量2,3-丁二醇，當這種物質濃度過高時能產生黃油、奶酪氣味[20]。上述研究表明，草莓酒發(fā)酵液中較高豐度的假絲酵母菌很可能與自然發(fā)酵草莓酒口感更為醇厚，有機酸種類較多，香氣更豐富[5]的酒體特征存在密切關系。

本研究顯示，發(fā)酵初期的非釀酒酵母菌是早期發(fā)酵的主要動力。菌群差異分析顯示，隱球酵母在發(fā)酵初、中、末期存在較顯著的菌群衰亡，而假絲酵母與畢赤酵母在發(fā)酵初期至中期存在顯著菌群增殖。這表明，假絲酵母與畢赤酵母可能是發(fā)酵初期主要的產酒酵母。研究顯示，畢赤酵母可為酒體帶來更多的酯類，以及揮發(fā)性酚類物質，如4-乙基苯酚、4-乙基-2甲氧基苯酚等，這些酚類物質在適宜的濃度下可增加酒的復雜度，但過量會產生刺鼻的異味[20]。此外，畢赤酵母多數(shù)能以甲醇為唯一碳源生長代謝，對降低酒體中的甲醇含量具有一定作用[22]。這表明，本研究中的畢赤酵母可能與草莓酒風味之間同樣存在密切關系。

擲孢酵母屬是草莓酒中豐度較高的非釀酒酵母，菌群差異分析顯示，其在發(fā)酵過程中的豐度無顯著性差異，表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的菌群狀態(tài)。盡管一般認為該類酵母與酒類發(fā)酵無關[9]，但研究顯示，該屬中的一些種可以產生酯類物質，如具有桃子、芒果及草莓果香的γ-癸內酯[23-24]，以及脂肪酸（亞油酸、亞麻酸等）[25]、可作為酒類增香劑的β-葡糖苷酶[26]等。此外，該屬大多數(shù)菌株都能產生色素（如類胡蘿卜素）[27]。因此該類非釀酒酵母可能與草莓酒的香氣、顏色等感官品質存在一定關系。

4　小結

總之，本文利用高通量測序技術，本研究初步闡明了2017年4月底自然發(fā)酵草莓酒中的真菌群落結構與動態(tài)變化。分析顯示，Pilidium、子囊菌門未確定屬（unidentified）、葡萄孢霉屬（Botrytis）是草莓酒自然發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌群。假絲酵母屬（Candida）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、畢赤酵母屬（Pichia）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、亞羅酵母屬（Yarrowia）是主要的非釀酒酵母。其中，葡萄孢霉屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬與草莓酒的理化及感官品質可能存在較為密切的關系。