細(xì)胞膜合成途徑模塊化調(diào)控與形態(tài)改造提高大腸桿菌β-胡蘿卜素的積累與產(chǎn)量

武陶，張柏林，畢昌昊

1 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083

2 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

β-胡蘿卜素 (β-carotene) 是類胡蘿卜素家族中的典型代表，也是生物體內(nèi)合成維生素 A 的前體物質(zhì)，具有極強(qiáng)的淬滅單線態(tài)氧和清除自由基的作用，廣泛應(yīng)用于化工、食品、保健品以及醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。目前，β-胡蘿卜素的合成方式主要有化學(xué)合成以及天然提取，化學(xué)合成具有潛在危險(xiǎn)性，而天然提取的β-胡蘿卜素產(chǎn)量比較低，因此，近年來微生物細(xì)胞工廠合成天然產(chǎn)物越來越受到人們的重視[3]。大腸桿菌遺傳背景清楚、操作簡單，以大腸桿菌作為出發(fā)菌株，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建生產(chǎn)類胡蘿卜素的基因工程菌，已成為包括β-胡蘿卜素在內(nèi)的多種類胡蘿卜素產(chǎn)品生產(chǎn)的新模式[4-5]。針對生產(chǎn)β-胡蘿卜素的底盤細(xì)胞的改造，主要包括激活其自身的2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑)[6-8]，引入外源MVA途徑[9-11]，提高大腸桿菌合成IPP和DMAPP能力，另外，Alper等[12]通過轉(zhuǎn)座子文庫篩選出改造靶點(diǎn)，通過對所選靶點(diǎn)的單基因敲除、雙基因敲除以及三基因敲除，達(dá)到提高前體物質(zhì)供給的目的。其中，三基因敲除的菌株，其番茄紅素產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比提高了40%。Kang等[13]通過shot-gun文庫篩選出dxs、appY、crI、rpoS等可以增加番茄紅素產(chǎn)量的靶點(diǎn)。通過dxs與appY的共表達(dá)，番茄紅素的產(chǎn)量與對照相比提高了7倍。此外，Zhao等[14]通過調(diào)控中央代謝途徑，增強(qiáng) ATP與還原力 NADPH的供給，β-胡蘿卜素產(chǎn)量比出發(fā)菌株高64%。

雖然改造大腸桿菌生產(chǎn)萜類化合物有20多年的研究，但是以前的研究主要集中在途徑改造方面，關(guān)于萜類化合物在大腸桿菌細(xì)胞中的積累機(jī)制的報(bào)道很少。萜類化合物屬于一類疏水性較強(qiáng)的化合物，絕大部分不能分泌到胞外。其疏水性按照玉米黃素 (Zeaxanthin)、角黃素 (Canthaxanthin)、β-胡蘿卜素、番茄紅素的順序依次增加。之前有研究顯示疏水萜類化合物有可能和細(xì)胞膜結(jié)合，積累在膜附近區(qū)域，但是未見對疏水萜類化合物在細(xì)胞內(nèi)積累機(jī)制的深入研究和明確結(jié)論[15]。細(xì)胞膜主要由磷脂 (Phospholipid) 和蛋白質(zhì) (Protein)組成。細(xì)胞膜的磷脂中，70%–80%組分為磷脂酰乙醇胺 (Phosphatidylethanolamines)，15%–20%組分為磷脂酰甘油 (Phosphatidylglycerols)，剩余5%或更少的部分由心磷脂 (Cardiolipin) 構(gòu)成[16]。如果通過改造細(xì)胞膜形態(tài)或細(xì)胞形態(tài)使細(xì)胞膜含量變多，占細(xì)胞膜比例較大的磷脂酰乙醇胺的含量可能是細(xì)胞膜量的一個限制因素。

前期研究表明，改變細(xì)胞膜形態(tài)以及增加3-磷酸甘油二酯的供給，均可使細(xì)胞膜的量增加，容納更多的β-胡蘿卜素，并提高其產(chǎn)量[17]。然而在之前的研究中，沒有系統(tǒng)討論細(xì)胞膜的磷脂中主要組分磷脂酰乙醇胺的合成途徑對β-胡蘿卜素積累的影響。本研究將磷脂酰乙醇胺的合成途徑分為上、中、下游3個模塊，對它們的多種表達(dá)組合策略進(jìn)行比較 (圖 1)。在前期研究的基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步調(diào)控磷脂酰乙醇胺的合成，提高底盤菌CAR016發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

圖1 膜工程改造策略 (磷脂酰乙醇胺的合成途徑分為上、中、下游 3個模塊 (module1-module3)，在膜改造細(xì)胞中對它們的多種表達(dá)組合策略進(jìn)行比較)Fig. 1 General illustration of our research. The synthesis of phosphatidylethanolamine was divided into three modules and expressed in different combinations to discuss their synergetic effect on CAR016.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

氨芐青霉素、氯霉素，購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國 Axygen 公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；Trans 2K Plus DNA marker、EasyTaqPCR SuperMix DNA 聚合酶購自北京全式金物工程公司；Prime STARTMHS DNA聚合酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；Golden ViewⅠ型核酸染色劑購自北京索萊寶科技有限公司；Phusion TM超保真DNA聚合酶購自NEB公司；β-胡蘿卜素標(biāo)品購自美國Sigma 公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)，Shimadzu UV-2550spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)；PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉(zhuǎn)儀MicroPulser；臺式高速離心機(jī)，Eppendorf 5415D；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series1200。

1.1.3 菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g氯化鈉；氯霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為 34、50 μg/mL。LB固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

LB+2%甘油培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化鈉和20 mL甘油。

1.2.2 β-胡蘿卜素產(chǎn)量的檢測方法

將保存于–80 ℃的菌種在 LB平板上劃線活化，挑取單菌落接種到15 mm×100 mm試管 (含4 mL LB培養(yǎng)基) 中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，后按 1%的接種量轉(zhuǎn)接到 100 mL三角瓶 (含10 mL LB+2%甘油培養(yǎng)基) 中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h。收集菌液用于測定β-胡蘿卜素的含量。測定 β-胡蘿卜素產(chǎn)量時，先取適量待測菌液，16 200×g離心3 min，無菌水清洗后，用1 mL丙酮懸浮沉淀，在55 ℃黑暗條件下萃取15 min，然后將樣品在16 200×g下離心10 min，含有β-胡蘿卜素的上清過濾后用于測定β-胡蘿卜素的含量。用高效液相色譜測定[8]。

檢測條件：VWD檢測器，Symmetry C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶二氯甲烷(21∶21∶8)，流速1.0 mL/min，時間30 min，柱溫30 ℃，檢測波長453 nm。每個待測樣品分別有3個平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3個重復(fù)的平均值。用購自Sigma公司的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

此外，細(xì)胞干重(DCW)通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：1OD600= 0.323 g DCW/L。

1.3 磷脂酰乙醇胺含量的測定方法

測定磷脂酰乙醇胺含量時，樣品的前處理方法如下：取1 mL待測菌液，與3.75 mL氯仿/甲醇/12 mol/L HCl (2∶4∶0.1，V/V)充分混合后，加入1.25 mL氯仿并渦旋振蕩30 s，之后加入1.25 mL純水并同樣振蕩30 s。然后將上述樣品在5 000×g下離心10 min，將下層的氯仿層取出，并轉(zhuǎn)移至新的Ep管中，后將溶劑吹干，得到樣品干粉，用于后續(xù)HPLC測定[18]。

檢測條件：ELSD檢測器，Si-60色譜柱，流動相為正己烷∶異丙醇∶1%乙酸(49.5∶49.5∶1)。柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，時間20 min，每個待測樣品分別有3個平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3個重復(fù)的平均值。用購自Sigma公司的磷脂酰乙醇胺標(biāo)品構(gòu)建HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this work

1.4 Golden Gate法構(gòu)建質(zhì)粒

本研究主要以Golden Gate DNA酶切連接方法[19]來構(gòu)建質(zhì)粒。首先，采用PCR的方法擴(kuò)增目的基因片段或載體片段，通過引物將Golden Gate酶切位點(diǎn)埋入片段兩端，然后切膠回收得到目的片段，而后在體系加入內(nèi)切酶BsaⅠ或BsmBⅠ，以及T4 DNA連接酶、T4 DNA連接酶緩沖液等，進(jìn)行酶切連接；后將得到的Golden Gate反應(yīng)液轉(zhuǎn)化至工程菌感受態(tài)，涂于含有相應(yīng)的抗生素的平板上，過夜培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化子；最后，設(shè)計(jì)合適的引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并可進(jìn)一步通過測序證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用R軟件，通過t-test與one-way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析，*代表試驗(yàn)組與對照組之間的差異 (***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 上游合成模塊 (Module 1) 對于β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

為了系統(tǒng)討論細(xì)胞膜的磷脂中主要組分磷脂酰乙醇胺的合成途徑對 β-胡蘿卜素積累的影響，本研究將磷脂酰乙醇胺的合成途徑分為上、中、下游3個模塊，并對它們的多種表達(dá)組合策略進(jìn)行比較 (圖1)。為了保證Acyl-ACP的充足供給，在β-胡蘿卜素底盤菌CAR016中過表達(dá)上游模塊1，即來源于谷氨酸棒狀桿菌的脂肪酸合酶 (FAS) 基因。從圖 2的發(fā)酵結(jié)果可看出，模塊1在β-胡蘿卜素底盤菌CAR016中過表達(dá)后，單位細(xì)胞的 β-胡蘿卜素產(chǎn)量以及 β-胡蘿卜素的產(chǎn)量顯著提高 (P<0.01)，分別達(dá)到 13.7 mg/g DCW和44 mg/L。與對照組相比，分別提高35.6%和30.5%。

上述結(jié)果表明，上游模塊1的過表達(dá)可以充分形成Acyl-ACP，從而可以保證有足量的Acyl-ACP被用于下游產(chǎn)物磷脂酰乙醇胺的合成，為儲存β-胡蘿卜素提供更多的空間，達(dá)到提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量的目的。

圖2 上游合成模塊1對CAR016發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Fig. 2 Effect of module 1 on β-carotene production of CAR016. ***P<0.001.

2.2 中游以及下游膜合成模塊 (Module 2，Module 3) 過表達(dá)對于β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響

將磷脂酰乙醇胺合成途徑的中游與下游模塊，具體包括兩種3-磷酸-甘油-?；D(zhuǎn)移酶 (plsb與 plsc) (Module 2)、CDP-甘油二酯合成酶(cdsa)、磷脂酰絲氨酸合成酶 (pssa) 以及磷脂酰絲氨酸脫羧酶 (psd) (Module 3) 過表達(dá)。從圖3的發(fā)酵結(jié)果可看出，過表達(dá)模塊2 (Module 2)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量與單位細(xì)胞的β-胡蘿卜素產(chǎn)量均有提高，分別為103.5 mg/L和19.8 mg/g DCW[17]。與對照菌株CAR016 (pACYC184-M) 相比，分別提高1.4倍和94.1%。單獨(dú)過表達(dá)模塊3 (Module 3)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量與單位細(xì)胞的 β-胡蘿卜素產(chǎn)量與對照菌株相比，無顯著差異，這可能是由于單獨(dú)強(qiáng)化下游模塊時，有可能由于其上游前體3-磷酸-甘油二酯 (Diacylglycerol-3-P) 的供給不足，導(dǎo)致β-胡蘿卜素以及單位細(xì)胞的 β-胡蘿卜素產(chǎn)量沒有進(jìn)一步提高。

圖3 中游以及下游膜合成模塊 (Module 2，Module 3)對于CAR016發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of module 2 and module 3 on β-carotene production of strain CAR016. ***P<0.001.

上述發(fā)酵結(jié)果表明，磷脂酰乙醇胺合成途徑的中游與下游模塊 (Module 2，Module 3) 對于提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量有不同的影響。過表達(dá)中游模塊 2，可以保證細(xì)胞內(nèi)有充足的 3-磷酸甘油二酯，形成適量的磷脂酰乙醇胺，從而形成充足的細(xì)胞膜[17]，為細(xì)胞儲存β-胡蘿卜素提供了充足的空間，并且提高了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。過表達(dá)下游模塊3時，由于上游前體可能供應(yīng)不足，導(dǎo)致β-胡蘿卜素產(chǎn)量沒有明顯的提高。

2.3 上、中、下3個模塊隨機(jī)組合對CAR016發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

為了進(jìn)一步強(qiáng)化磷脂酰乙醇胺的合成途徑，在單獨(dú)過表達(dá)模塊1、模塊2、模塊3的基礎(chǔ)上，將上述3個模塊進(jìn)行隨機(jī)組合，考察磷脂酰乙醇胺合成途徑的上、中、下游3個模塊的組合對于CAR016發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響。

圖4 上中下3個模塊隨機(jī)組合對CAR016發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Fig. 4 The random combination effect of moudule 1,module 2 and module 3 on β-carotene production of CAR016. ***P<0.001; **P<0.01.

上、中、下游3個模塊的3種組合，均可以使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量以及單位細(xì)胞的 β-胡蘿卜素產(chǎn)量顯著提高 (P<0.001) (圖4)，但是，模塊3與其余模塊的組合，菌株的β-胡蘿卜素的產(chǎn)量與單位細(xì)胞 β-胡蘿卜素的產(chǎn)量均低于菌株 CAR016(pModule2) 的產(chǎn)量 (圖 3，圖 4)，并且細(xì)胞的生長也會受到一定的抑制。根據(jù)上述結(jié)果推測，膜折疊蛋白Almgs與模塊3之間沒有良好的協(xié)同作用，在菌株 CAR016中，通過引入膜折疊蛋白Almgs使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變[17]，而CDP-甘油二酯 (CDP-diacylglycerol) 是合成磷脂酰乙醇胺和心磷脂 (Cardiolipin) 的共同前體[20]。所以，在CAR016中同時過表達(dá)模塊2和模塊3，可能造成磷脂酰乙醇胺過多，磷脂酰乙醇胺與心磷脂等細(xì)胞膜各組成磷脂間的比例被破壞，不能很好地形成細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜的數(shù)量下降，β-胡蘿卜素的儲存空間不足，未能提高其產(chǎn)量。此外，模塊3中的3個蛋白可能會影響膜折疊蛋白Almgs的正確定位及其正常功能的發(fā)揮，最終影響β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。而在 CAR016中同時過表達(dá)模塊 1和模塊2后，菌株CAR016 (pModule1，pModule2)的單位細(xì)胞β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為22.3 mg/g DCW(圖 4)。與對照菌株 CAR016 (pTrc99A-M，pACYC184-M) 相比，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量以及單位細(xì)胞 β-胡蘿卜素的產(chǎn)量分別提高 1.8倍和 1.2倍(P<0.001)。

這一現(xiàn)象表明，磷脂合成的中游途徑(Module 2) 與上游脂肪酸合酶途徑 (Module 1)的組合，可以進(jìn)一步加強(qiáng)磷脂酰乙醇胺的合成途徑，使細(xì)胞膜的數(shù)量增加，在膜改造的細(xì)胞工廠中為儲存β-胡蘿卜素提供更多的空間，從而進(jìn)一步提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。然而模塊3與其他模塊并不存在有利的加成作用。

2.4 不同改造方式對細(xì)胞磷脂酰乙醇胺 (PE)含量的影響

為了進(jìn)一步研究磷脂酰乙醇胺含量與β-胡蘿卜素產(chǎn)量之間的關(guān)系，針對前述試驗(yàn)中得到的β-胡蘿卜素產(chǎn)量較高的3個菌株，測定其細(xì)胞中磷脂酰乙醇胺的含量，具體結(jié)果如表2所示。

從表2的測定結(jié)果可以看出，磷脂酰乙醇胺合成的上游模塊1與模塊2同時過表達(dá)，與單獨(dú)表達(dá)模塊2相比，磷脂酰乙醇胺的含量有提高。模塊1、2、3同時共表達(dá)，細(xì)胞中磷脂酰乙醇胺的含量與模塊1、2共表達(dá)時沒有顯著差異。

該結(jié)果表明，磷脂酰乙醇胺的含量對β-胡蘿卜素的產(chǎn)量有影響，但兩者之間并不是嚴(yán)格的正相關(guān)關(guān)系。

表2 不同模塊改造后磷脂酰乙醇胺的含量Table 2 The content of phosphatidyl ethanolamine in different modulation

2.5 上、中兩個模塊組合對CAR025-37Almgs發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

為了進(jìn)一步證明上游與中游兩個模塊在增加細(xì)胞膜的數(shù)量方面有協(xié)同作用，將上述兩個模塊同時導(dǎo)入之前構(gòu)建的 β-胡蘿卜素菌株 CAR025-37Almgs中，考察上、中兩個模塊對其發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響。

圖5的發(fā)酵結(jié)果表明，在高產(chǎn)菌株CAR025-37Almgs中同時表達(dá)模塊 1與模塊 2，單位細(xì)胞的β-胡蘿卜素產(chǎn)量為47.5 mg/g DCW，與對照菌株相比，提高了49.5%。

圖5 上、中兩個模塊組合對 CAR025-37Almgs發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Fig. 5 The combination effect of Module1 and Module 2 on β-carotene production of CAR025-37Almgs.**P<0.01.

3 結(jié)論

本研究在前期研究得到的 β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌CAR016的基礎(chǔ)上，通過引入脂肪酸合酶體系以及磷酯酰乙醇胺中游、下游合成模塊，達(dá)到強(qiáng)化其合成途徑并且保證其上游前體物質(zhì)供應(yīng)充足的目的。研究表明，在CAR016中同時過表達(dá)模塊1和模塊 2，單位細(xì)胞 β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為 22.3 mg/g DCW，是本研究中的最高產(chǎn)量菌株 (圖 6)，通過模塊化優(yōu)化，改造菌株比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了118.6%。強(qiáng)化磷酯酰乙醇胺的上游 (Module1) 及中游 (Module 2) 合成模塊，可以產(chǎn)生更大量的細(xì)胞膜，為儲存 β-胡蘿卜素提供更多的空間，同時進(jìn)一步提高 β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。針對細(xì)胞膜的形態(tài)以及合成途徑進(jìn)行模塊化改造，可以作為今后提高類胡蘿卜素和其他疏水化合物產(chǎn)量的新方向。

圖6 細(xì)胞膜合成途徑模塊化調(diào)控對膜改造細(xì)胞工廠β-胡蘿卜素單位細(xì)胞產(chǎn)量的影響Fig. 6 Diagram summarizing the increase of β-carotene specific production obtained through modularized engineering of membrane synthesis.

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