Spt蛋白與釀酒酵母壓力抗性研究進展

蘆志龍，陸琦，陳英，吳仁智，黃俊，陳小玲，陳東，黃日波

1 廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530005

2 廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005

3 廣西科學(xué)院 國家非糧生物質(zhì)能源研究工程中心，廣西 南寧 530007

Spt蛋白是一系列具有轉(zhuǎn)座子突變回復(fù)能力、與釀酒酵母抗性高度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄過程的一大類調(diào)控因子[1-5]。Spt蛋白因此已成為全局轉(zhuǎn)錄工程的改造對象，并且已取得了一定的成效[6-8]。然而，針對 Spt蛋白的研究還存在一定的盲區(qū)。一是沒有針對 Spt蛋白調(diào)控下的轉(zhuǎn)座子群的行為對酵母適應(yīng)和進化的影響，尤其是對壓力環(huán)境下的研究。二是沒有針對Spt蛋白在壓力環(huán)境下通過細胞膜壁重塑進行調(diào)控的研究。我們通過耐高溫發(fā)酵釀酒酵母轉(zhuǎn)錄組比較分析和表達差異的溯源發(fā)現(xiàn)，一些Spt蛋白 (如Spt23) 的突變體在釀酒酵母高溫環(huán)境適應(yīng)性方面發(fā)揮了主導(dǎo)作用，而且這種作用可能部分是通過轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的。基于Spt23的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控將成為一種極具潛力的釀酒酵母改造手段。本文嘗試從Spt蛋白通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)座突變回復(fù)及細胞膜轉(zhuǎn)變這3個方面來增強釀酒酵母抗性的潛在作用作綜合闡述，并對當前研究中的不足提出了一些針對性的建議。

1 Spt與SAGA復(fù)合體

釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是個復(fù)雜的過程，涉及到大量的全局調(diào)控因子，并由它們調(diào)控著數(shù)目巨大但彼此間聯(lián)系松散的基因群[9]。它們通常是作為大型蛋白分子復(fù)合體的單元發(fā)揮作用的：它們有的通過核小體相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制的程度，有的直接與其他轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，有的作為RNA聚合酶中與DNA相互作用的亞基發(fā)揮作用。但大體上，釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄調(diào)控被分為兩種不同的機制。

一是TFII參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動。Spt蛋白便是具有這些特征的酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。這類蛋白通常與組蛋白編碼基因或者 TATA結(jié)合蛋白(TBP蛋白) 相關(guān)聯(lián)。以酵母Spt15為例，它是由Spt15編碼的大小為27 kDa的蛋白，又被稱為d因子，是 TFIID的一個亞基，是RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ的組成成分，對于轉(zhuǎn)錄的起始過程是不可或缺的。Spt15具有結(jié)合TBP的功能，結(jié)合 TBP的速率關(guān)系著轉(zhuǎn)錄激活的效率。TFIID參與了約90%的酵母轉(zhuǎn)錄活動。

二是SAGA復(fù)合體參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動。約有10%的酵母基因轉(zhuǎn)錄是通過SAGA復(fù)合體(Spt-Ada-Gcn5乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體) 來實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的[10]。SAGA復(fù)合體是能夠重塑染色質(zhì)構(gòu)象，結(jié)合TATA區(qū)域，協(xié)助RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄的多亞基復(fù)合體[11]。SAGA的構(gòu)象依據(jù)調(diào)控的基因不同而改變。SAGA復(fù)合體具有組蛋白的乙?；D(zhuǎn)移酶活力和去泛素酶活力[12]。

RNA聚合酶Ⅱ的這兩類轉(zhuǎn)錄活動呈現(xiàn)出明顯的差異性，因此被命名為TFIID-型和SAGA-型。前者調(diào)控范圍廣泛，調(diào)控基因多為基本生命活動相關(guān)的看家基因，調(diào)控的方式較為疏散；后者調(diào)控范圍較小，調(diào)控基因多與環(huán)境壓力應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，且調(diào)控方式較為緊密。SAGA調(diào)控的基因大部分是與酵母的高滲透壓、有害代謝物等環(huán)境壓力應(yīng)激反應(yīng)如 MAPK、HOG途徑高度相關(guān)的[13-17]。對于在環(huán)境壓力下表達上調(diào)的基因，與SAGA調(diào)控的關(guān)聯(lián)性尤其顯著。隨著表達差異分析技術(shù)的進步，關(guān)于TFIID-型和SAGA-型調(diào)控的認識基本明確：兩種復(fù)合體獨立地、全局地參與RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄活動，只是前者結(jié)合于UAS (上游激活序列區(qū))，后者則直接結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始位點[18-20]。SAGA-型通過激活因子介導(dǎo)而結(jié)合到啟動子區(qū)域，TFIID是直接結(jié)合啟動子區(qū)域的[17]。

SAGA復(fù)合體的調(diào)控活動是通過修改染色質(zhì)形態(tài)來實現(xiàn)的。核小體結(jié)合于 DNA之上，通常使基因的轉(zhuǎn)錄處于抑制狀態(tài)。SAGA復(fù)合體通過轉(zhuǎn)乙?；饔酶淖兒诵◇w中組蛋白與 DNA的結(jié)合狀態(tài)，從而使轉(zhuǎn)錄因子能夠順利地結(jié)合順式作用元件，開始轉(zhuǎn)錄活動。但是對于復(fù)合體發(fā)揮作用的完整細節(jié)，目前還沒有定論。Grant等提出了兩種由Ada復(fù)合體-Spt復(fù)合體相互作用的SAGA轉(zhuǎn)錄激活模型[3]。一是Ada復(fù)合體和 Spt復(fù)合體各自獨立但均包含Gcn5，因而都具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活力，只不過它們二者均通過未知的Ada蛋白 (或Spt蛋白) 與不同的激活因子相互作用而激活轉(zhuǎn)錄；二是只有 Ada復(fù)合體包含 Gcn5蛋白而具有了組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活力，但必須通過與Spt復(fù)合體的相互作用才能使SAGA復(fù)合體結(jié)合至 TATA區(qū)域，從而啟動轉(zhuǎn)錄 (圖 1)。這兩種模型都被認為還有其他未發(fā)現(xiàn)的Ada蛋白和Spt蛋白。

圖1 SAGA復(fù)合體啟動轉(zhuǎn)錄需要Spt蛋白參與的核小體亞基去乙?；^程Fig. 1 Initialization of transcription by SAGA complex requires deactylation of nucleosome subunits implemented by Spt proteins. Spt proteins and Ada, Gcn could alternate chromation configuration by deactylaltion of nuclesome subunits and initialize transcription of RNA polymeraseⅡ.

Spt蛋白廣泛地參與了釀酒酵母的兩類轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。但 Spt蛋白是個比較龐大的家族，各個成員也存在著巨大的差異。常見的SAGA復(fù)合體 Spt蛋白有 Spt3、Spt7、Spt8和 Spt20等。它們相互之間并不調(diào)節(jié)彼此的轉(zhuǎn)錄活性。為了區(qū)別于Spt15這樣的TBP作用形式，它們被歸類為Spt3類 Spt蛋白。依據(jù) Spt蛋白重要程度的不同，Sterner等將它們分成3組。第1組包括Spt7、Spt20和Ada1，它們的突變會導(dǎo)致酵母難以利用大多數(shù)碳源，是SAGA復(fù)合體中不可或缺的成員。而Spt3和Spt8組成的第 2組與由 Gcn5、Ada2和 Ada3組成的第3組則會導(dǎo)致部分碳源不能利用，其程度較第 1組要輕微得多[21]。Spt蛋白間可能存在功能的重合，這表現(xiàn)在當一個Spt基因被敲除后，酵母并不會死亡。Spt蛋白呈現(xiàn)出的多樣性，可以用不同的方式進行分類，比如通過調(diào)節(jié)方式或轉(zhuǎn)座子抑制活力來區(qū)分，此處不再贅述[22-23]。

Spt23則不依賴于SAGA復(fù)合體發(fā)揮調(diào)控作用。Spt23被重新密集研究，是因為它在轉(zhuǎn)座抑制作用之外[24]，還對釀酒酵母配型調(diào)控發(fā)揮著重要作用。MAT基因座左右方向分別為HML和HMR兩個基因。在單倍體酵母中，二者只有一個可以被轉(zhuǎn)錄，另一個被沉默，從而避免出現(xiàn)非交配性酵母。這個沉默過程是由被沉默基因兩翼的E和I沉默子區(qū)域，以及一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用完成。其中，Sir1–Sir4起主要作用。這4種任何一種的敲除均不能導(dǎo)致酵母死亡，但會導(dǎo)致部分或全部的轉(zhuǎn)錄沉默現(xiàn)象的消失。Rap1、Abf1以及ORC六亞基復(fù)合體介導(dǎo)了Sir蛋白與E或I沉默子區(qū)域的結(jié)合。通過Sir蛋白與H3、H4組蛋白相互作用，對染色質(zhì)的構(gòu)象進行調(diào)整。而 Sum1可以抑制因 Sir蛋白突變導(dǎo)致的沉默能力的失效。在SUM1缺失的菌株中開展的染色體缺失實驗中，發(fā)現(xiàn)有Spt23、MGA2等4個位點的缺失可以補償Sum1的效應(yīng)[25]?？梢奡pt23/MGA2的轉(zhuǎn)錄激活能力，與配型基因的沉默機制相互競爭，從而改變一些基因的轉(zhuǎn)錄水平。即便如此，Spt23及其同源體MGA2對沉默機制的作用細節(jié)并不完全相同。比如，在SIR2敲除的酵母中，Spt23/MGA2與HML的沉默作用形成了拮抗關(guān)系；但在HML的沉默子區(qū)域突變的酵母中，Spt23/MGA2似乎又強化了沉默作用。這種機制的實現(xiàn)細節(jié)尚未明了，但Spt23通過染色質(zhì)構(gòu)象調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的能力無疑得到印證。

當然，SAGA復(fù)合體并非唯一的依賴染色質(zhì)形態(tài)重塑進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能體。Swi-Snf復(fù)合體同樣具有染色質(zhì)形態(tài)重塑、組蛋白乙?；⒄{(diào)控轉(zhuǎn)錄的能力[26-28]。事實上這個系統(tǒng)與SAGA復(fù)合體功能有相互重疊，在一定程度上是冗余的。此外，Srb/Mediator復(fù)合體也與 SAGA復(fù)合體有一定程度的結(jié)構(gòu)和功能冗余[5,29-31]。比如，Spt23也可以抑制由SNF2敲除所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄缺陷現(xiàn)象，而這種功能通常由 Srb/Mediator調(diào)控因子復(fù)合體來實現(xiàn)[32]?？傮w上，雖然3個復(fù)合體實現(xiàn)機制有相似之處，但它們各自調(diào)控的基因各不相同[4]。為此，Roberts等構(gòu)建了一個 SAGA、Swi-Snf、Srb/Mediator三個復(fù)合體共同調(diào)節(jié)酵母RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄行為的模型[5]。

2 Spt對轉(zhuǎn)座子的作用

Spt蛋白因為其抑制轉(zhuǎn)座子活力的特性而被發(fā)現(xiàn)和命名。酵母轉(zhuǎn)座子Ty是一類具有在基因組中遷移整合能力的多拷貝基因。Ty轉(zhuǎn)座子具有反轉(zhuǎn)錄病毒樣的蛋白表達序列基因，兩側(cè)由正向重復(fù)的δ序列包圍。δ序列具有多樣性，典型δ序列長度約為330 bp，包含有一個帶TATA框的啟動子和一個終止子[33-34]。δ序列也可以分散地存在于基因組中，成為酵母進化過程中轉(zhuǎn)座子活動的足跡。轉(zhuǎn)座子遷移會產(chǎn)生多樣的基因變異，徐崗詳盡列舉了轉(zhuǎn)座子可產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)，如插入、刪除、染色體結(jié)構(gòu)變異，多達 20余種[35]。轉(zhuǎn)座子移動性和突變性的特點，催生轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)在20世紀90年代的興起，這進而導(dǎo)致越來越多的轉(zhuǎn)座子抑制基因被發(fā)現(xiàn)。δ序列具有其自身的TATA框啟動子，當它插入到基因上游就可能形成相互競爭的雙TATA框結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合到錯誤的位點 (圖2A)。如HIS4基因的啟動子區(qū)域被轉(zhuǎn)座子或δ序列插入后，便失去了轉(zhuǎn)錄活性，無法在組氨酸營養(yǎng)缺陷型篩選培養(yǎng)基上存活。當Spt作用于轉(zhuǎn)座子序列時，能夠促使轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合到正確的TATA框，抑制了轉(zhuǎn)座子突變性，從而使轉(zhuǎn)錄活性失而復(fù)得 (圖2B)。此時，HIS4基因能夠轉(zhuǎn)錄出天然長度的mRNA，從而使菌株能夠在組氨酸營養(yǎng)缺陷型篩選培養(yǎng)基上存活。后續(xù)的研究表明，兩個TATA框結(jié)構(gòu)存在競爭作用，而Spt突變蛋白能夠起始正確的轉(zhuǎn)錄。與此同時，轉(zhuǎn)座子自身的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也會被抑制[36]。依據(jù)調(diào)控轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)錄的強弱程度，Spt蛋白被分為2類。Spt3、Spt7、Spt8和Spt15中的任何一個基因的突變都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄水平的強烈下調(diào)。其余Spt蛋白歸入一組，對于轉(zhuǎn)座子的調(diào)控能力較弱[37]。

不同的 Spt蛋白對轉(zhuǎn)座子突變的抑制作用呈現(xiàn)一定的偏好性。Spt13、Spt14對完整轉(zhuǎn)座子 (Ty)插入突變的回復(fù)轉(zhuǎn)錄能力極強，但對于δ因子插入突變的回復(fù)能力弱[37-39]。Spt23則對δ因子在起始位點上游不同插入位點造成的突變均具有較強的突變回復(fù)能力[24]。而 Spt3則對轉(zhuǎn)座子 Ty和 δ因子插入突變引發(fā)的轉(zhuǎn)錄失活均有回復(fù)能力[40-41]。Spt蛋白的這種回復(fù)能力存在劑量效應(yīng)，以Spt23為例，只有多拷貝 Spt23被表達的時候才具有抑制轉(zhuǎn)座子突變的表型；單拷貝表達不具備配型調(diào)節(jié)能力。

轉(zhuǎn)座子對于生物具有重要的進化意義。轉(zhuǎn)座子是生物獲得基因組多樣性的重要原因。例如，基因組的重排行為依賴于轉(zhuǎn)座子衍生的重組酶。轉(zhuǎn)座子序列構(gòu)成了人類基因組的45%左右，與發(fā)育和疾病關(guān)系密切；植物基因組的大小差異，很大程度上源于TE (轉(zhuǎn)座元件) 數(shù)目的差別。轉(zhuǎn)座子對于在惡劣環(huán)境下的適應(yīng)性扮演重要角色[42]。轉(zhuǎn)座子是新基因的進化來源之一[43]。釀酒酵母轉(zhuǎn)座子的豐富度在一定程度上反映了酵母通過轉(zhuǎn)座子突變得到進化優(yōu)勢的能力。因此，通過 Spt蛋白對釀酒酵母轉(zhuǎn)座子群進行調(diào)控，從而改變其在壓力環(huán)境下得到優(yōu)良性狀的能力，無疑將是今后重點探索的方向之一。

圖2 Spt蛋白通過競爭性結(jié)合TATA框回復(fù)轉(zhuǎn)座子突變的原理示意圖Fig. 2 Spt proteins reccovery transposon induced mutations by competitive enrollment to TATA boxes. (A) Transposons or δ-sequences randomly insert into promoter regeion of genes to form a dual-TATA box structure. Transcription fails as RNA polymerase binds to the wrong TATA box. (B) Spt mutants enables RNA polymerase subunits to bind the native TATA box with higher affinity and neglect the allian one to start transcription, demonstring the ablity to recovery transposon induced mutations.

3 Spt的調(diào)控與酵母菌株改造

如前文所述，Spt調(diào)控基因通常與酵母抗性高度相關(guān)。多種環(huán)境壓力誘導(dǎo)的酵母應(yīng)激反應(yīng)均會造成細胞膜的變化和細胞壁重塑。以9%乙醇耐受研究中的釀酒酵母細胞為例，細胞膜由于高濃度乙醇的存在導(dǎo)致完整性降低，直接表現(xiàn)是細胞膜厚度的減小，薄的細胞膜進而導(dǎo)致細胞壁的剛性和光滑度劇烈降低。并且，由此產(chǎn)生的細胞壁的重塑作用是獨立于細胞壁完整性通路 (CWI) 的[2]。Spt23是一個極為特殊的Spt蛋白，在于其調(diào)控過程與細胞膜重塑的高度相關(guān)性。它主要參與不飽和脂肪酸合成 (OLE1) 調(diào)控。不飽和脂肪酸是組成細胞膜的重要成分，與細胞膜的流動性和形態(tài)有密切的關(guān)系[44-45]。You等通過基因敲除的方式發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸，尤其是油酸對于釀酒酵母耐受乙醇能力起到至關(guān)重要的作用[46]。Spt23通過改變細胞膜不飽和脂肪酸的含量提高了酵母抵御環(huán)境壓力的能力 (圖 3)。不飽和脂肪酸的含量和組成反過來也可以調(diào)控Spt23轉(zhuǎn)錄活性。Spt23對不飽和脂肪酸的調(diào)節(jié)機制依賴 Cdc48-Npl4-Ufd1復(fù)合體。該復(fù)合體在真核生物膜介導(dǎo)的細胞過程中發(fā)揮重要作用。它可以指導(dǎo)依賴泛素-蛋白酶體的蛋白裂解，并激活兩個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定蛋白Spt23和它的同源蛋白Mga2。這兩個蛋白直接激活OLE1基因轉(zhuǎn)錄 Δ-9脂肪酸脫飽和酶。Spt23和MGA1是同源基因，同為人源NF-κB的同源體。若Spt23和MGA1同時敲除時，酵母無法在不含不飽和脂肪酸的培養(yǎng)基上生長[32]。兩者功能有重合，但不完全相同。比如，MGA1在膽固醇的合成中，對ERG1基因的轉(zhuǎn)錄起到關(guān)鍵作用，而Spt23卻不能調(diào)控[47]。但單就二者的不飽和酸合成調(diào)控能力而言，它們都具有改變細胞膜的組分、提高酵母抗性的潛力。我們可以依據(jù) Spt23及其同源體蛋白的調(diào)控特點，設(shè)計相應(yīng)的改造手段來提高酵母的抗性水平，尤其是耐高溫發(fā)酵的性能。

圖3 Spt23基因通過調(diào)控細胞膜不飽和脂肪酸含量提高酵母抗性Fig. 3 Spt proteins play a roll in stress resistance of budding yeast by regulating the species and ratio of unsaturated lipid acids. A: Spt23 regulates the transcription of OLE1, the key enzyme in unsaturated lipid acids synthesis; B: unsaturated lipid acids synthesis by ole1; C: ratio of unsaturated lipid acids in the phospholipid bi-layer changed accordingly to the environmental turbulence; D: environmental stress resistance strengthened through unsaturated lipid acids constitution change in the cell membrane.

Spt23的活化機制已被闡釋清楚。泛素化的Spt23的無活性前體p120最初錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。p120通過二聚體化后具備了活性。但活化后蛋白質(zhì)分子p90與未活化分子p120并不分離，而是依靠分子間的 IPT結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起。p90分子的泛素化修飾特征在此過程中保留。依賴Cdc48-Npl4-Ufd1復(fù)合體的作用，p90與其前體p120解離，成為可溶的、定位于細胞核的成熟蛋白分子。在Cdc48-Npl4-Ufd1復(fù)合體中， Cdc48對泛素化蛋白具有選擇性，同時對于膜的融合發(fā)揮重要作用。Ufd1不僅直接參與OLE1基因的調(diào)控，而且參與不穩(wěn)定泛素化分子的降解。Npl4不僅是一種轉(zhuǎn)運蛋白，而且緊密參與不飽和脂肪酸調(diào)控的UFD (泛素融合降解蛋白) 途徑。p90解離的方式是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位信號 (C端跨膜區(qū))被降解而實現(xiàn)的。其N端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)保存完整。p90被運輸?shù)郊毎酥?，開始調(diào)控OLE1基因的表達，從而影響了細胞不飽和脂肪酸的合成。正是由于Spt23基因調(diào)控過程中有蛋白酶體的深度參與，Auld等傾向于將其機制歸類為蛋白酶體轉(zhuǎn)錄調(diào)控的范疇。蛋白酶體轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要的調(diào)控形式包括轉(zhuǎn)錄因子加工和蛋白酶體-染色質(zhì)關(guān)聯(lián)[1]。

通過 Spt的全局轉(zhuǎn)錄工程從細胞整體水平上進行轉(zhuǎn)錄水平的擾動，進而獲得優(yōu)良性狀是一種有益的嘗試。對參與細胞轉(zhuǎn)錄起始的所有轉(zhuǎn)錄因子，利用包括易錯PCR、基因重排等多種手段，得到活力發(fā)生變化的轉(zhuǎn)錄因子，最終引導(dǎo)代謝流向有利于目標產(chǎn)物的方向。國內(nèi)有通過對Spt15基因進行飽和突變，得到飽和突變文庫，將文庫轉(zhuǎn)入釀酒酵母，篩選得到具有葡萄糖木糖共發(fā)酵的釀酒酵母菌株[7]。筆者認為，這株獨特的釀酒酵母菌株可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得了木糖代謝的基因，但是受碳源經(jīng)濟性的限制而受到轉(zhuǎn)錄抑制；通過Spt15的改造，RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄譜偏好發(fā)生轉(zhuǎn)換，開啟了相關(guān)基因表達，從而產(chǎn)生了木糖代謝的表型。山東大學(xué)通過Spt15基因的刪除和導(dǎo)入，探討對釀酒酵母高滲透壓和高乙醇耐受性能力的影響[48]。曹喜濤等針對Spt15和TAF25開展了基于易錯 PCR的全局轉(zhuǎn)錄工程改造，結(jié)果使S-腺苷蛋氨酸釀酒酵母生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量提高了1.8?2.0倍[8]。也有針對Spt3開展的全局轉(zhuǎn)錄工程改造研究，用于提高釀酒酵母產(chǎn)乙醇水平[6]。

4 Spt通過轉(zhuǎn)座調(diào)控酵母抗性

前文已對釀酒酵母轉(zhuǎn)座子的突變性和遷移性作了闡述。正是由于轉(zhuǎn)座子具有遷移性，它們可以隨機地開啟或關(guān)閉一些基因的轉(zhuǎn)錄過程。根據(jù)廣西科學(xué)院工業(yè)生物科學(xué)與技術(shù)研究中心的初步分析結(jié)果，釀酒酵母轉(zhuǎn)座子和δ序列的數(shù)目與酵母乙醇耐受性呈現(xiàn)一定的負相關(guān)性。例如，含有381個δ序列的遺傳高產(chǎn)菌株1015，其耐高滲和耐乙醇水平要遠遠高于含有771個δ序列的低產(chǎn)菌株 1415。但兩者的 δ序列數(shù)目差異是否由Spt23基因的突變所引發(fā)還需要進一步的實驗支持。通過乙醇高溫發(fā)酵的表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Spt23蛋白的點突變會導(dǎo)致1015菌株轉(zhuǎn)座子表達量下調(diào)，與此同時其高溫發(fā)酵產(chǎn)酒率 (37 ℃條件下) 提高了2%，甚至能在54 ℃熱擊后仍可存活，作為對比的出發(fā)菌株完全滅活 (未發(fā)表)。通過對Spt23蛋白突變前后的轉(zhuǎn)錄組比較發(fā)現(xiàn)，突變后的Spt23基因促使大部分可調(diào)控基因表達量下調(diào) (圖 4)。通過對常溫和高溫乙醇發(fā)酵釀酒酵母轉(zhuǎn)錄組進行了表達差異分析，并利用基于網(wǎng)絡(luò)算法的數(shù)量性狀連鎖分析手段將差異表達的誘因追溯到特定的基因突變。eQTL即表達數(shù)量性狀位點分析，依據(jù)的原理是差異表達基因傾向于由相互緊密互作關(guān)系的驅(qū)動基因串驅(qū)動的。其方法是將公開數(shù)據(jù)庫得到的細胞互作數(shù)據(jù)，依據(jù)互作程度強弱形成帶權(quán)重的有向圖，將全部基因表達程度作為節(jié)點間重值，從差異表達基因出發(fā)，通過二元決策的算法上溯至最可能的驅(qū)動突變子[49-50]。結(jié)果表明，Spt23是等級最高 (Rank=1)、驅(qū)動基因數(shù)目最多 (137個)、驅(qū)動效應(yīng)最明顯的基因 (絕大部分被調(diào)控基因表達下調(diào)，見圖4)。Rank反映了差異表達基因與突變基因間關(guān)聯(lián)程度的強弱，這與Spt系列基因的全局調(diào)控能力是相吻合的。同時，可以從圖中看到有3個轉(zhuǎn)座子 (YER137C-A、YMR045W和YIL082W-A) 發(fā)生了表達差異是可以追溯到Spt23的基因突變的。推測這3個轉(zhuǎn)座子基因插入位點上下游的基因可能在提高釀酒酵母抗性水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此有必要開展更深入的研究。將來可以通過Spt23的全局轉(zhuǎn)錄工程改造和Spt23突變庫的轉(zhuǎn)座子活力干擾來探索提高釀酒酵母對環(huán)境壓力的抗性。由此可見，Spt23從兩個層面上對轉(zhuǎn)錄進行了調(diào)控：一是作為通用轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用；二是調(diào)控轉(zhuǎn)座子活性而發(fā)揮活性。兩種層面都是全局性的、效果顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖4 Spt23突變體導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄下調(diào)和高溫耐受性提高Fig. 4 Down regulation by Spt23 mutant leads to enhancement of high temperature stress resistance. Tracking of driving mutant for the genes with transcriptional level changed was implemented by PheNetic eQTL. The direction of regulation goes was indicated by arrows. The strength of regulation was indicated by the width of arrows. Different interaction types are represented by the colors of arrows, in which red for DNA-protein interaction. Red in center of the regulated genes indicated up-regulation, while green for down-regulation. The intensity of color indicted the extend of up-/down-regulation.

5 研究方向展望

上文介紹很多針對Spt進行全局轉(zhuǎn)錄工程改造的研究。整體上看，這些研究絕大部分注重RNA聚合酶自身亞基的改造，這是合理的，但是有局限性。事實上，影響全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控的因素極其繁多，RNA聚合酶自身亞基只是其中的一部分。我們認為更多的研究應(yīng)當關(guān)注SAGA復(fù)合體亞基，尤其是非RNA聚合酶亞基的Spt蛋白 (如非Spt15) 在釀酒酵母環(huán)境壓力耐受性方面的應(yīng)用，比如Spt3、Spt4、Spt8等。而Spt23可以從全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控改造、轉(zhuǎn)座子抑制和細胞膜重塑3個方面發(fā)揮酵母抗性增強的潛在作用，應(yīng)當成為優(yōu)先研究的對象。

除了擴展全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程的研究對象外，更重要的是改變 Spt系列蛋白的表達水平。作為釀酒酵母重要的生命機制之一的轉(zhuǎn)錄過程，其參與者眾多、功能互有重疊，點突變或敲除產(chǎn)生的性狀變化往往有限。相比而言，改變啟動子產(chǎn)生的影響可能更大。為此，適當采用啟動子重排的方法，通過一定的手段改變Spt基因各自的啟動子，使其活力有高有低，形成不同的活力譜，從而改變信息的傳遞路徑和通量，最終對性狀產(chǎn)生影響。這種策略已經(jīng)作為一種代謝組研究工具應(yīng)用于木糖發(fā)酵釀酒酵母菌株的開發(fā)[51-52]。從實現(xiàn)難度上看，目前有成熟的 DNA組裝的方法[53]。如基于Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的“金門”克隆可以快速隨機地重排啟動子，有助于該策略的開展[54]。

針對 Spt蛋白做釀酒酵母環(huán)境壓力耐受性研究，除了從全局轉(zhuǎn)錄工程入手外，還可以通過Spt的轉(zhuǎn)座子抑制效應(yīng)來改造釀酒酵母。雖然目前已知 Spt蛋白、轉(zhuǎn)座子和酵母抗性存在著一定的關(guān)聯(lián)性，其作用機理仍然不全面、不詳盡，這也將是 Spt蛋白調(diào)控研究的一個方向。具體而言，今后的研究應(yīng)當解決的問題包括但不限于：Spt蛋白對轉(zhuǎn)座子的全局調(diào)控機制；Spt蛋白不同突變體和全基因組中轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)以及 δ序列數(shù)目間的聯(lián)系；Spt蛋白不同突變體對釀酒酵母總體轉(zhuǎn)座活力的影響；轉(zhuǎn)座總體活力對釀酒酵母抗性的影響；轉(zhuǎn)座總體活力對釀酒酵母基因水平轉(zhuǎn)移能力 (從環(huán)境中得到進化優(yōu)勢基因) 的影響；Spt蛋白賦予酵母抗性時各個作用方式的權(quán)重等。

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