甘草內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性研究

楊林，王磊, 胥彤，何俊杰

蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)及工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730050

1.緒論

甘草是中國(guó)2000多種草藥中用量最大的一種傳統(tǒng)中藥材，具有調(diào)和諸藥、益氣補(bǔ)脾、祛痰止咳、清熱解毒、預(yù)防癌癥等功效，素有“十方九草，無(wú)草不成方”之說(shuō)[1]。烏拉爾甘草具有明顯抗病毒[2]、抗炎[3]、抗菌及抗血栓[4]等作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究甘草根內(nèi)生真菌分離鑒定及其代謝產(chǎn)物抑菌活性研究，篩選出甘草抑菌活性內(nèi)生真菌，為甘草資源綜合開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1.1 甘草藥理作用研究現(xiàn)狀

（一）抗菌與抗病毒活性：甘草多年臨床應(yīng)用于病毒性呼吸系統(tǒng)疾病、肝炎、呼吸系統(tǒng)感染、口腔潰瘍等多種細(xì)菌或病毒性疾病，提示甘草可能具有良好的抗菌和抗病毒作用。現(xiàn)代試驗(yàn)表明，甘草的水提取部位、甲醇提取部位、超臨界提取物都具有一定的抗菌活性，對(duì)多種革蘭陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用[5]。

（二）抗炎作用：甘草具有皮質(zhì)激素樣抗炎作用。甘草水煎劑能抑制被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)，降低小鼠血清IgE抗體水平，但對(duì)SRBC致IgG抗體的產(chǎn)生無(wú)影響[6]。

（三）抗病毒作用：甘草甜素對(duì)人體免疫性缺陷病毒(HIV，艾滋病毒)，肝炎病毒及水痘，帶狀皰病毒等的增殖有抑制作用[6]。

（四）抗癌活性：甘草提取物可直接有效抑制乳腺癌、歐利希腫瘤、埃列希腹水腫瘤、子宮內(nèi)膜癌及多種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖，同時(shí)還能有效抑制肺癌的轉(zhuǎn)移[5]。

1.2 內(nèi)生真菌生物活性研究進(jìn)展

近些年，植物內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在生物醫(yī)學(xué)方面研究成為熱點(diǎn)，內(nèi)生真菌作為一種潛力巨大的微生物資源，從其代謝產(chǎn)物中篩選尋找有價(jià)值的先導(dǎo)化合物已成為新藥研發(fā)的重要途徑和來(lái)源。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生抗生素類、抗氧化類、抗腫瘤類[7]等其他活性物質(zhì)。

2.材料與方法

2.1 植物材料

烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)，于2015年11月購(gòu)于甘肅民勤，由蘭州理工大學(xué)生命學(xué)院楊林副教授鑒定。

2.2 甘草內(nèi)生真菌的分離及鑒定

將烏拉爾甘草的根沖洗干凈,用75%的乙醇泡12min,用無(wú)菌水沖洗三次，再用3%的NaClO浸泡15min，用無(wú)菌手術(shù)刀在超凈工作臺(tái)將其切成1cm的小段，將其放置于PDA培養(yǎng)基表面，在27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d,定期觀察,當(dāng)切口處長(zhǎng)出菌落時(shí)及時(shí)將菌落挑入新的PDA培養(yǎng)基中純化[8]。將真菌接種到平板上，插上滅菌的蓋玻片，生長(zhǎng)完全后放于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落、菌絲體、孢子形態(tài)。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》 初步鑒定。

2.3 次級(jí)代謝產(chǎn)物的制備

將分離得到的內(nèi)生真菌接種于PD培養(yǎng)基中，在27℃ 120r/min的空氣浴搖床中培養(yǎng)10d，將得到的發(fā)酵液抽濾，將菌絲體放入干燥箱中烘干備用，菌液分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，將有機(jī)層的萃取物收集并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮備用；將干燥的菌絲體用研缽研磨均勻后用30倍體積的甲醇回流提取3次，每次1h，過(guò)濾，合并甲醇提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮備用，將乙酸乙酯、正丁醇、甲醇三種部位的樣品放入50℃條件下干燥至恒重[9]。

2.4 抑菌活性測(cè)定[10]

采用濾紙片法測(cè)定各樣品抑菌活性，將5種指示菌（金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，綠膿桿菌、大腸桿菌、地衣芽孢桿菌）在37℃恒溫培養(yǎng)24h，活化后用無(wú)菌水配置成菌懸液，調(diào)節(jié)菌體濃度至106CFU/mL,吸取1mL均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，取直徑為6mm的無(wú)菌濾紙片，在無(wú)菌條件下用鑷子放置于上述已涂布的平板上，每皿3片，輕壓使其與培養(yǎng)基表面接觸，然后用微量移液器吸取備好的各測(cè)試樣品溶液（以甲醇稀釋至10mg/mL）15μL分別滴加于紙片上，以溶劑甲醇為陰性對(duì)照，以100U/mL的硫酸鏈霉素或青霉素鈉為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)平行。加樣后于37℃培養(yǎng)24h，十字交叉法測(cè)定各樣品抑菌圈大小。

最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定，選擇對(duì)樣品溶解度好且無(wú)抑菌作用的甲醇作為溶媒，采用二倍稀釋法將樣品制為10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.313mg/mL系列濃度溶液，用濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑，以本實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)抑菌圈的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

3.結(jié)果與分析

3.1 甘草內(nèi)生真菌分離及鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)從甘草根分離得到15株內(nèi)生真菌，通過(guò)形態(tài)及顯微鑒定（菌落形態(tài)、邊緣、基質(zhì)顏色、菌絲形態(tài)）共鑒定8株內(nèi)生真菌，分5個(gè)屬，其中菌株R101為毛霉屬（Mucor）、菌株R102、R108、R113為鐮刀菌屬（Fusarium）、菌株R105、R09為曲霉屬（Aspergillus）、菌株R106為青霉屬（Penicillium）、菌株R107為木霉屬（Trichoderma）。

3.2 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性結(jié)果

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甘草內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)各指示菌均有不同的抑制效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑菌活性的樣品占總數(shù)46.7%；對(duì)綠膿桿菌表現(xiàn)出抑菌活性的樣品占總數(shù)42.2%；對(duì)肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出抑菌活性的樣品占總數(shù)40%；對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抑菌活性的樣品占總數(shù)44.4%；對(duì)地衣芽孢桿菌表現(xiàn)出抑菌活性的樣品占總數(shù)28.9%。

活性樣品最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，樣品R108(NBE)、R108(MME)、R109(EAE)、R109(NBE)、R109(MME)對(duì)綠膿桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，其中R108（NBE）、R108（MME）、R109(EAE)的最小抑菌濃度分別為0.625mg/mL、0.312mg/mL、1.25mg/mL；R109（NBE）和R109（MME）最小抑菌濃度為2.5mg/mL。

表1最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

4.結(jié)論

本研究從甘草根分離得到15株內(nèi)生真菌，形態(tài)及顯微鑒定8株，初步判斷為毛霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬，其中鐮刀菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。帖衛(wèi)芳等[11]從甘草根分離內(nèi)生真菌，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行鑒定，確定優(yōu)勢(shì)菌落分別為鐮刀菌屬和赤霉菌屬。采用濾紙片法測(cè)定甘草內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性，結(jié)果表明，次級(jí)代謝產(chǎn)物3個(gè)部位45個(gè)樣品中有43個(gè)樣品表現(xiàn)出抑菌活性，占樣品總數(shù)95.6%。甘草內(nèi)生真菌具有作為發(fā)酵菌株生產(chǎn)活性成分原料的潛力，具有潛在的藥用價(jià)值。