經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺移植人臍血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的療效分析

于海燕 宮殿榮 袁曉玲 劉力峰 趙敏 王敏 蘆倩

細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病與損傷，特別是難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病是近些年新興的極具潛力及研究意義的生物治療方案，已有許多研究及報(bào)道從各方面說明細(xì)胞移植具有神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)修復(fù)、改善腦內(nèi)環(huán)境及調(diào)節(jié)免疫等作用，但這些研究多見于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，近幾年細(xì)胞移植的臨床研究逐漸開展起來，且移植方法多樣，包括靜脈注射、側(cè)腦室穿刺、腰椎穿刺和立體定向技術(shù)等。臨床上任何治療手段的前提是安全，選擇合適的細(xì)胞種類和移植途徑，保證細(xì)胞移植的可行性和安全性，在此前提下，才能研究探討療效。2017年10月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了臍血細(xì)胞療法擴(kuò)大臨床范圍，包括腦癱、自閉癥、腦缺血等，為更多神經(jīng)系統(tǒng)疾患提供研究性臍血療法。團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)[1-2]向枕大池內(nèi)移植人臍血單個(gè)核細(xì)胞（human umbilical cord blood mononuclear cells，hUCB-MNC），對(duì)230例難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者進(jìn)行了450次hUCB-MNC治療，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、病例資料

選取聊城市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2011年7月至2016年4月共230例難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病（12種疾病）患者，進(jìn)行寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCBMNC治療450次，男137例，女93例，年齡9 ～ 84歲（表1）。hUCB-MNC由聊城市人民醫(yī)院干細(xì)胞臨床研究實(shí)驗(yàn)室提供，臍血由聊城市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合相關(guān)疾病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）患者或家屬能夠配合檢查和治療過程并簽署知情同意書；（3）隨訪合作信息無丟失者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性腫瘤患者；（2）活動(dòng)性結(jié)核患者或存在嚴(yán)重的感染性疾患未被控制者；（3）心、肝、腎或其他臟器嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病患者；（4）精神疾病患者；（5）嚴(yán)重的血液疾病或凝血功能障礙者；（6）過敏體質(zhì)者。

表1 寰枕間隙側(cè)方穿刺hUCB-MNC移植病種、病例數(shù)及穿刺次數(shù)

二、方法

（一）治療前檢查

1.安全性指標(biāo)檢查：血常規(guī)+血沉、生化全項(xiàng)、全身腫瘤標(biāo)記物、病毒篩查、出凝血機(jī)制、胸部正側(cè)位X線片。

2.療效性檢查：顱腦MR、肌電圖、腦脊液化驗(yàn)等根據(jù)不同病種各自完善。

（二）獲取臍血單個(gè)核細(xì)胞

臍血檢測(cè)示乙肝七項(xiàng)、HCV、HIV、梅毒等其它相關(guān)傳染性指標(biāo)均呈陰性，無倫理問題。干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員用臍帶血細(xì)胞體外分離試劑盒（加拿大威爾森公司研制，寧夏中聯(lián)達(dá)生物有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：SCR-200I）使用說明書進(jìn)行操作，去除所有的紅細(xì)胞、血小板、血漿和粒細(xì)胞，保留幾乎所有的單個(gè)核細(xì)胞，獲得5 ml hUCB-MNC懸液，行細(xì)胞質(zhì)量檢測(cè)：包括細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD系統(tǒng)檢測(cè)、細(xì)菌培養(yǎng)、內(nèi)毒素檢測(cè)等。hUCB-MNC終制品細(xì)胞活性≥95﹪，細(xì)胞收集計(jì)數(shù)為（2 ～ 3）×108個(gè)，純度≥98﹪。

（三）寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)移植hUCB-MNC

患者或其委托人知情同意，并簽署細(xì)胞治療知情同意書和寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)知情同意書?；颊呷フ硌雠P，標(biāo)記穿刺點(diǎn)。常規(guī)消毒鋪洞巾，利多卡因逐層局部麻醉后，行寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)，緩慢將 5 ml hUCB-MNC 懸液計(jì)數(shù)為（2 ～ 3）×108個(gè)導(dǎo)入枕大池內(nèi)，并置換等量腦脊液。操作過程嚴(yán)格遵循無菌原則，術(shù)后患者去枕臥位8 h。接受≥2次治療的患者，治療間隔時(shí)間一般為28 d，自第1次治療后開始計(jì)算隨訪時(shí)間。

表2 部分檢驗(yàn)指標(biāo)治療前與治療后3個(gè)月對(duì)比

表3 患者經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺hUCB-MNC移植治療后療效比較（n）

（四）觀察指標(biāo)

治療全程及治療后24 h內(nèi)嚴(yán)密觀察患者一般情況及生命體征（T、P、R、Bp）。觀察患者有無穿刺點(diǎn)出血、局部血腫、頭痛、頭暈等。每位患者分別在治療前，治療后3個(gè)月在我院進(jìn)行血樣檢測(cè)（血常規(guī)+血沉、生化全項(xiàng)、全身腫瘤標(biāo)記物、病毒篩查、出凝血機(jī)制）。檢測(cè)前提為患者無感染、無合并嚴(yán)重的其他臟器疾病等。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

應(yīng)用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，治療前后患者血常規(guī)+血沉、生化全項(xiàng)、全身腫瘤標(biāo)記物、病毒篩查和出凝血機(jī)制結(jié)果以± s表示，治療前后化驗(yàn)指標(biāo)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不良反應(yīng)

230例患者共進(jìn)行了450次細(xì)胞治療，有32例在治療后6 h內(nèi)出現(xiàn)一過性血壓升高，最高者180/110 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa），發(fā) 生 率7.1﹪，對(duì)癥治療及心理疏導(dǎo)后于24 h內(nèi)血壓恢復(fù)基線水平，考慮與患者緊張情緒有關(guān)。有8例治療后12 h內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫37.3 ℃～ 38.5 ℃，發(fā)生率1.8﹪，予對(duì)癥降溫治療后體溫恢復(fù)正常，無反復(fù)。10例穿刺時(shí)訴穿刺處深部軟組織脹痛，拔針后疼痛消失，發(fā)生率2.2﹪。所有患者治療后均無頭痛、感染、血腫形成、反復(fù)發(fā)熱、皮疹、抽搐等不良反應(yīng)和其它移植并發(fā)癥出現(xiàn)。

二、血液學(xué)指標(biāo)

患者血常規(guī)+血沉、生化全項(xiàng)、全身腫瘤標(biāo)記物、病毒篩查、出凝血機(jī)制在治療前后無明顯差異（表 2）。

三、療效

有183例患者在治療后出現(xiàn)病情改善，并在隨訪時(shí)間內(nèi)持續(xù)好轉(zhuǎn)，部分痊愈，有效率79.6﹪（表3）。

討 論

某些難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病如變性疾?。ò柎暮Ｄ喜?、多系統(tǒng)萎縮、帕金森、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病和一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病等）、腦血管病后遺癥、神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病等，用傳統(tǒng)的治療方法療效差甚至無效。而細(xì)胞移植因其特殊的生物學(xué)功能，為難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治愈提供了可能性。其中臍血作為最豐富的細(xì)胞庫(kù)，在臨床的應(yīng)用早已不限于血液系統(tǒng)疾病，其衍生的hUCB-MNC更具有以下優(yōu)越性[3-4]：（1）采集、分離方法簡(jiǎn)便，無創(chuàng)傷，無倫理學(xué)爭(zhēng)議；（2）因其免疫系統(tǒng)的原始性，抗原性極低，相對(duì)安全；（3）有較強(qiáng)的增殖、分化能力，壽命更長(zhǎng)。

hUCB-MNC為混合細(xì)胞群，含有幾種類型的干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞，調(diào)控T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，這些細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展過程中有積極的保護(hù)作用[5]。人臍血細(xì)胞含有高水平的CD34+和CD105+細(xì)胞標(biāo)記，標(biāo)志著其有較高的再生潛力[6]，研究也發(fā)現(xiàn)hUCBMNC具備較高的分化潛能，能在特定環(huán)境的誘導(dǎo)下向多個(gè)方向分化[7-9]，其腦內(nèi)移植可存活并能減輕腦損傷[10]，hUCB-MNC移植入腦內(nèi)后，不僅可分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子[11-13]，還能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)因子釋放[14]，保護(hù)神經(jīng)和修復(fù)神經(jīng)損傷，重建再生微環(huán)境。還有研究表明hUCB-MNC能夠通過調(diào)節(jié)免疫機(jī)制而在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到治療作用[15-17]。團(tuán)隊(duì)的臨床觀察也證明hUCB-MNC治療對(duì)難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病如一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病、多系統(tǒng)萎縮等有治療作用，并且安全可靠，無明顯不良反應(yīng)和致瘤性[18-21]。

宮殿榮教授獨(dú)創(chuàng)的寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)，以往也曾稱為“枕大池側(cè)方穿刺法”[1]，經(jīng)過20余年的臨床檢驗(yàn)，證實(shí)非常安全可靠[2]，自2011年起，團(tuán)隊(duì)將寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)與hUCB-MNC移植結(jié)合，從寰枕間隙側(cè)方進(jìn)針，將細(xì)胞直接導(dǎo)入枕大池內(nèi)。

目前神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植途徑主要有靜脈注射、側(cè)腦室穿刺、腰椎穿刺、立體定向移植等途徑。對(duì)比以上幾種途徑，寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)用于hUCB-MNC移植有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)將hUCB-MNC直接導(dǎo)入枕大池，與病灶更接近，避免了細(xì)胞經(jīng)靜脈移植途徑中經(jīng)過循環(huán)和組織器官的消耗，也避免了移植的細(xì)胞是否能通過血腦屏障這一尚不明確的問題[22]；其次，枕大池與第四腦室直接相通，目前側(cè)腦室穿刺法移植的干細(xì)胞已被證實(shí)可以特異性的遷移至腦損傷區(qū)域，并與宿主細(xì)胞在形態(tài)和功能上形成良好的整合[23]，所以寰枕間隙側(cè)方穿刺移植hUCB-MNC即可以達(dá)到側(cè)腦室穿刺同等的效果，又能減少創(chuàng)傷和并發(fā)癥；對(duì)比腰椎穿刺[24]，寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)操作時(shí)不須擺放特殊體位，適合于任何需要留取腦脊液檢查或椎管內(nèi)注入藥物的患者，尤其是病情嚴(yán)重不能隨意擺放體位、或氣管插管、意識(shí)障礙，肌張力過高的患者，而且腰穿注射的細(xì)胞隨腦脊液被動(dòng)循環(huán)行程較長(zhǎng)，細(xì)胞在各神經(jīng)根處有不可避免的消耗、丟失，而寰枕間隙側(cè)方就可彌補(bǔ)這一問題；立體定向移植技術(shù)可以直接將細(xì)胞注入病變部位或周圍，多適用于病變部位明確和局限的疾病如腦血管病、帕金森氏病等，但是對(duì)于一些病變部位廣泛彌漫的疾病如遲發(fā)性腦病、多系統(tǒng)萎縮等，該技術(shù)的適應(yīng)癥要窄一些，所以寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)可以作為一種可行的替補(bǔ)方法。所以綜合以上，寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)具有成功率高、適應(yīng)癥廣、創(chuàng)傷小、療效好等優(yōu)點(diǎn)[25]，可以作為細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的首選或替代途徑。

本研究利用寰枕間隙側(cè)方穿刺移植hUCBMNC對(duì)230例患者進(jìn)行450次注射治療，均未發(fā)現(xiàn)任何相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)和并發(fā)癥，血液學(xué)檢查及基本生命體征均無明顯變化，說明經(jīng)寰枕間隙側(cè)方穿刺移植hUCB-MNC方法是安全可行的。

本研究應(yīng)用hUCB-MNC移植治療10余種疾病，其中以一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病、多系統(tǒng)萎縮、腦血管病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病為多，隨訪發(fā)現(xiàn)多數(shù)患者病情好轉(zhuǎn)，部分痊愈。并且發(fā)現(xiàn)接受治療越早，療效越好。大部分遲發(fā)性腦病患者在接受1 ～ 3次治療后，病情明顯好轉(zhuǎn)，甚至痊愈，多系統(tǒng)萎縮、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、腦血管病后遺癥者平均接受3 ～ 4次治療，有2例多系統(tǒng)萎縮患者，在治療后3 d內(nèi)病情即明顯好轉(zhuǎn)[19-21]。在以后的臨床研究中會(huì)繼續(xù)深化、細(xì)化，針對(duì)不同疾病完善試驗(yàn)設(shè)計(jì)、增加對(duì)照組、量化試驗(yàn)結(jié)果、完善隨訪計(jì)劃和評(píng)價(jià)方法等，以尋找最佳治療時(shí)間窗、治療周期和有效的細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)結(jié)合臨床前基礎(chǔ)研究，為細(xì)胞在提供更有力的理論支撐。

細(xì)胞移植技術(shù)為目前用傳統(tǒng)方法難以見效的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了希望，也成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，細(xì)胞治療的種類和移植方法的多樣性也給此類研究帶來了多向選擇性。目前細(xì)胞移植最受關(guān)注的還是臨床安全性這個(gè)前提，通過230 例臨床樣本的研究，對(duì)寰枕間隙側(cè)方穿刺術(shù)hUCBMNC移植的安全性進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，提示該技術(shù)是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)很好的值得推廣的方法，期望本文能為細(xì)胞移植的安全性提供參考和依據(jù)，也能為細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用帶來新的思路。

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