腎透明細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞系差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

朱合歡 趙虎 林智文 王潔 路君 譚建明

腎癌作為一種常見的實(shí)體腫瘤，約占成人惡性腫瘤的2﹪～ 3﹪，在泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率僅次于膀胱癌。據(jù)CA-Cancer J Clin報(bào)道，美國僅在2015年就有大約60 000新發(fā)腎癌病例，且有14 000人左右死于該病[1]。腎透明細(xì)胞癌是腎癌中最常見的病理類型，約占腎癌各種類型的70﹪，因?yàn)槠淙狈τ行У脑缙谠\斷方法及特定的生物標(biāo)志物，30﹪的患者在初次診斷時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。由于腎透明細(xì)胞癌對(duì)放化療均不敏感，其治療手段目前仍以外科手術(shù)為主。然而腎透明細(xì)胞癌具有轉(zhuǎn)移性的特點(diǎn)，部分患者即使經(jīng)過手術(shù)治療，仍舊會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，且轉(zhuǎn)移后的患者預(yù)后明顯較差[3]。隨著分子醫(yī)學(xué)及相關(guān)技術(shù)（如基因芯片技術(shù)）的快速發(fā)展，大量腫瘤生物標(biāo)志物相繼被發(fā)現(xiàn)并逐步應(yīng)用于臨床[4-6]。然而，當(dāng)前尚未有腎透明細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物在臨床上投入使用。因此，探討腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并找到在該過程中起關(guān)鍵作用的基因及相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)腎透明細(xì)胞癌的靶向治療具有重要指導(dǎo)作用。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)基因芯片GSE78179中的2種腎臟細(xì)胞系（轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞系和胚胎起源的正常腎上皮細(xì)胞（ASE-5063細(xì)胞系）進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），同 時(shí) 對(duì)DEGs進(jìn)行聚類綜合分析，同時(shí)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而找到核心基因及相關(guān)重要信號(hào)通路，為腎透明細(xì)胞癌進(jìn)一步研究其診斷及治療提供了理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

（一）數(shù)據(jù)材料

利用NCBI中GEO芯片數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）對(duì)目標(biāo)芯片進(jìn)行檢索，檢索詞為“clear cell renal cell carcinoma，Homo”。經(jīng)篩選后，采用由Khan等[7]提交的芯片數(shù)據(jù)（GSE78179），該芯片以Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2（Probe Name version）為平臺(tái)，共收集了6例細(xì)胞樣本，其中3例為腎透明細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞系樣本，3例為正常腎組織ASE-5063細(xì)胞系樣本。

（二）分析軟件及數(shù)據(jù)庫

GEO2R基因在線分析工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），Metascape 基 因 聚 類 在線 分 析 工 具（http://metascape.org/gp/index.html），STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)在線分析工具（http://stringdb.org/），Cytoscape繪圖軟件（http://www.cytoscape.org/）及其插件“MCODE”；Funrich基因富集分析軟件（http://www.funrich.org/）。

二、方法

采用GEO數(shù)據(jù)庫的GEO2R在線分析工具對(duì)兩種細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)的基因。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|logFC|≥5，adj.P≤0.01。將篩選出的差異表達(dá)導(dǎo)入Metascape中進(jìn)行GO （Gene Ontology）功能富集及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）等通路的綜合分析，然后將DEGs導(dǎo)入STRING中進(jìn)行基因相互作用的可視化。接著將STRING的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape中，并利用MCODE篩選出核心基因互作網(wǎng)絡(luò)，最后對(duì)核心互作網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行GO與KEGG通路分析。

結(jié) 果

（一）DEGs篩選結(jié)果

按照設(shè)定的篩選條件，與ASE-5063細(xì)胞系相比進(jìn)行分析，在Caki-1細(xì)胞系中共篩選出562個(gè)DEGs，其中345個(gè)上調(diào)，217個(gè)下調(diào)。篩選結(jié)果按照|logFC|值排序，上調(diào)與下調(diào)排名前5名的基因見表1。

表1 上調(diào)與下調(diào)排名前5名的差異表達(dá)基因

（二）DEGs綜合分析

在Metascape中對(duì)DEGs進(jìn)行功能及通路富集分析，按照P值大小排序，前20名富集結(jié)果見圖1a。P值最小的2個(gè)GO富集結(jié)果表明這些差異基因與脈管系統(tǒng)的發(fā)育（vasculature development）以及泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育（urogential system development）密切相關(guān)。前20名富集功能相互關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)圖見圖1b。

（三）DEGs相互作用可視化及核心網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果

圖1 差異表達(dá)基因Metascape分析結(jié)果

將DEGs在STRING中可視化分析，除去孤立無互作的基因節(jié)點(diǎn)（node），將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape，篩選出302個(gè)具有相互作用關(guān)系節(jié)點(diǎn)，構(gòu)成了一個(gè)包涵859個(gè)互作關(guān)系對(duì)（edge）的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)（圖2a）。利用Cytoscape軟件中的MCODE插件，對(duì)圖2a中的網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行K核解析（k-core decomposition），篩選出網(wǎng)絡(luò)中的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。最終篩選出了2個(gè)得分最高的子網(wǎng)絡(luò)，分別為由13個(gè)關(guān)鍵基因（Key Genes）及78個(gè)互作關(guān)系對(duì)組成的圖2b和由23個(gè)關(guān)鍵基因及52個(gè)互作關(guān)系對(duì)組成的圖2c。

（四）子網(wǎng)絡(luò)GO功能分析及KEGG通路富集情況

圖2 差異、核心基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

通過將子網(wǎng)絡(luò)中的36個(gè)關(guān)鍵基因?qū)隖unRich軟件進(jìn)行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因在分子功能（molecular function）上主要富集細(xì)胞黏附分子活性（cell adhesion molecule activity）、輔因子結(jié)合（cofactor binding）、趨化因子活性（chemokine activity）等相關(guān)功能上（圖3a），而這些功能在生物學(xué)進(jìn)程（biological process）上主要與細(xì)胞通訊（cell communication）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）等密切相關(guān)（圖3b）。在STRING中的KEGG通路分析表明這些關(guān)鍵基因與趨化因子信號(hào)通路（chemokine signaling pathway）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）以及 NF-κB 信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）等有著緊密的聯(lián)系（表 2），為使結(jié)果更加清晰可讀，其中部分通路及與之相關(guān)的基因的關(guān)系對(duì)在Cytoscape中進(jìn)行可視化（圖4）。

討 論

腫瘤的整個(gè)發(fā)生發(fā)展進(jìn)程往往有著多個(gè)基因參與，現(xiàn)階段隨著基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的快速發(fā)展，各種類型的腫瘤逐漸在全基因組水平上被系統(tǒng)的深入研究[8]。在此研究中，通過分析腎透明細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞系和正常的腎細(xì)胞ASE-5063細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在Caki-1細(xì)胞系中高表達(dá)的基因345個(gè)，低表達(dá)基因217個(gè)。通過Metascape中的GO分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)DEGs與脈管系統(tǒng)發(fā)育及泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。隨后使用K核解析篩選出這些DEGs中的關(guān)鍵基因如CXCL2、IL8和FGF1等，這些關(guān)鍵基因GO功能分析和KEGG通路富集主要集中在趨化因子活性、TNF信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等。眾所周知，腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞而言具有生長旺盛的特點(diǎn)，因而Caki-1細(xì)胞系中的差異基因富集結(jié)果中有脈管系統(tǒng)發(fā)育以及參與細(xì)胞生長的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的各種信號(hào)通路，證實(shí)了篩選基因方法的合理性。富集通路中的趨化因子等信號(hào)通路提示Caki-1細(xì)胞具有一定的侵襲遷移能力，這也與目前諸多關(guān)于該細(xì)胞系的研究報(bào)道相符[9-11]。

圖3 核心基因GO功能富集分析

表2 核心基因KEGG通路富集分析

本研究中篩選出的與腎透明細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞系相關(guān)的核心基因，如IL-8（白細(xì)胞介素8）能夠影響治療腎透明細(xì)胞癌藥物舒尼替尼的抗血管生成能力，是舒尼替尼發(fā)生耐藥的重要促成因素[12]。另外，KEGG分析結(jié)果表明IL-8參與了NOD樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路以及NF-κB信號(hào)通路，已有大量相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了這些通路與腎透明細(xì)胞癌有著密不可分的聯(lián)系[13-15]。CXCL2（CXC趨化因子配體2）雖然尚未有研究報(bào)道其直接參與腎透明細(xì)胞癌的病理過程，但多個(gè)研究報(bào)道其在其他多種腫瘤疾病中發(fā)揮著重要作用。如在前列腺癌患者中CXCL2能夠顯著促進(jìn)患者的骨溶解，并能促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[16]；同樣，在乳腺癌患者中CXCL2也能促進(jìn)癌癥的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。和IL-8類似，KEGG分析結(jié)果表明CXCL2同樣參與了大量與腎透明細(xì)胞癌病程相關(guān)的信號(hào)通路如TNF信號(hào)通路[18]、NOD樣受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路以及NF-κB信號(hào)通路。其他核心基因如ITGB4（又名CD104），根據(jù)圖4結(jié)果表明其參與了PI3K-Akt信號(hào)通路、局部粘附和肌動(dòng)蛋白骨架的調(diào)節(jié)。據(jù)Nature報(bào)道，癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)（the Cancer Genome Atlas Research Network）的研究人員利用多個(gè)平臺(tái)對(duì)400余例腎透明細(xì)胞癌腫瘤進(jìn)行了綜合分析，鑒定出19個(gè)重要的突變基因，而與這些突變基因最為相關(guān)的信號(hào)通路則是PI3K-Akt信號(hào)通路，該通路涉及特定的DNA甲基化發(fā)生過程，從而在該腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[19]。其他研究則表明局部粘附和肌動(dòng)蛋白骨架的調(diào)節(jié)與細(xì)胞的遷移侵襲能力直接相關(guān)[20-21]。因此，與這三條信號(hào)通路密切相關(guān)的ITGB4基因有可能是腎透明細(xì)胞癌潛在的治療靶點(diǎn)，值得后續(xù)進(jìn)行更加深入的研究。

此研究通過生物信息學(xué)方法在腎透明細(xì)胞癌Caki-1細(xì)胞系中篩選出了數(shù)個(gè)核心基因，包括IL-8這種在腎透明細(xì)胞癌中被廣泛報(bào)道的基因，以及CXCL2和ITGB4這種廣泛參與多種腫瘤的病理進(jìn)程但尚未在腎透明細(xì)胞癌中報(bào)道的基因。通過對(duì)這些基因進(jìn)行功能分析及通路富集分析，有助于對(duì)腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制及病程進(jìn)展的進(jìn)一步研究。同時(shí)，篩選出的這些核心基因可通過后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可能會(huì)找到腎透明細(xì)胞癌的特異性臨床診斷標(biāo)志物并為其靶向治療提供有力支持，這為腎透明細(xì)胞癌的早期診斷以及后續(xù)靶向治療的研究提供了研究基礎(chǔ)。

1 Kopp RP, Stratton KL, Glogowski E, et al.Utility of prospective pathologic evaluation to inform clinical genetic testing for hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma[J].Cancer, 2017, 123(13):2452-2458.

2 Shingarev R, Jaimes EA.Renal cell carcinoma: new insights and challenges for a clinician scientist[J].Am J Physiol Renal Physiol,2017, 313(2):F145-F154.

3 Ni D, Ma X, Li HZ, et al.Downregulation of FOXO3a promotes tumor metastasis and is associated with metastasis-free survival of patients with clear cell renal cell carcinoma[J].Clin Cancer Res, 2014,20(7):1779-1790.

4 Kirwan A, Utratna M, O'dwyer ME, et al.Glycosylation-Based serum biomarkers for cancer diagnostics and prognostics[J].Biomed Res Int,2015:490531.

5 Liloglou T, Bediaga NG, Brown BR, et al.Epigenetic biomarkers in lung cancer[J].Cancer Lett, 2014, 342(2, SI):200-212.

6 Mazzone PJ, Sears CR, Arenberg DA, et al.Evaluating molecular biomarkers for the early detection of lung cancer: when is a biomarker ready for clinical use? an official American thoracic society policy statement[J].Am J Respir Crit Care Med, 2017, 196(7):e15-e29.

7 Khan MI, D?bski KJ, Dabrowski M, et al.Gene set enrichment analysis and ingenuity pathway analysis of metastatic clear cell renal cell carcinoma cell line[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 311(2):F424-F436.

8 Katheder NS, Khezri R, O'farrell F, et al.Microenvironmental autophagy promotes tumour growth[J].Nature, 2017, 541(7637):417-420.

9 Horiguchi A, Sumitomo M, Asakuma J, et al.Leptin promotes invasiveness of murine renal cancer cells via extracellular signalregulated kinases and rho dependent pathway[J].J Urol, 2006, 176(4 Pt 1):1636-1641.

10 Pei X, Li M, Zhan J, et al.Enhanced IMP3 expression activates NF-кB pathway and promotes renal cell carcinoma progression[J].PLoS One,2015, 10(4):e0124338.

11 Zhu J, Cui L, Xu A, et al.MEIS1 inhibits clear cell renal cell carcinoma cells proliferation andin vitroinvasion or migration[J].BMC Cancer,2017, 17(1):176.

12 Huang D, Ding Y, Zhou M, et al.Interleukin-8 mediates resistance to antiangiogenic agent sunitinib in renal cell carcinoma[J].Cancer Res,2010, 70(3):1063-1071.

13 Casta?o-Rodríguez N, Kaakoush NO, Goh KL, et al.The NOD-like receptor signalling pathway in Helicobacter pylori infection and related gastric cancer: a case-control study and gene expression analyses[J].PLoS One, 2014, 9(6):e98899.

14 Matu?an-Ilija? K, Damante G, Fabbro D, et al.EGFR expression is linked to osteopontin and Nf-kappaB signaling in clear cell renal cell carcinoma[J].Clin Transl Oncol, 2013, 15(1):65-71.

15 Tsaur I, Noack A, Waaga-Gasser AM, et al.Chemokines involved in tumor promotion and dissemination in patients with renal cell cancer[J].Cancer Biomark, 2011, 10(5):195-204.

16 Hardaway AL, Herroon MK, Rajagurubandara E, et al.Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer[J].Clin Exp Metastasis, 2015, 32(4):353-368.

17 Bachmeier BE, Mohrenz IV, Mirisola V, et al.Curcumin downregulates the inf l ammatory cytokines CXCL1 and -2 in breast cancer cells via NFkappaB[J].Carcinogenesis, 2008, 29(4):779-789.

18 Mikami S, Mizuno R, Kosaka T, et al.Expression of TNF-α and CD44 is implicated in poor prognosis, cancer cell invasion, metastasis and resistance to the sunitinib treatment in clear cell renal cell carcinomas[J].Int J Cancer, 2015, 136(7):1504-1514.

19 Cancer Genome Atlas Research Network.Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma[J].Nature, 2013,499(7456):43-49.

20 Kim DH, Wirtz D.Predicting how cells spread and migrate: focal adhesion size does matter[J].Cell Adh Migr, 2013, 7(3):293-296.

21 Lin WC, Wang LC, Pang TL, et al.Actin-binding protein G (AbpG)participates in modulating the actin cytoskeleton and cell migration in Dictyostelium discoideum[J].Mol Biol Cell, 2015, 26(6):1084-1097.