高表達microRNA-155的骨髓間充質(zhì)干細胞對免疫調(diào)節(jié)的影響

謝林岑 陳月秋 沈振亞

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）已廣泛應用于心血管疾病和移植物抗宿主病等疾病的治療[1-3]，但由于移植需要細胞數(shù)量巨大[4-5]、難以精確控制分化、治療效果不明顯等問題的暴露，MSC的臨床應用受到很大的限制。為了拓寬MSC的臨床應用，對MSC進行特異性干預就顯得尤為重要。有科學家對MSC進行改變基因表達[6]、炎癥因子預處理[7]、藥物預處理[8]等干預，其中改變MSC基因表達調(diào)控MSC免疫功能的研究相對較少。本研究前期發(fā)現(xiàn)同種異體心臟移植受體的miR-155表達明顯升高，經(jīng)MSC誘導免疫耐受可降低其miR-155的表達[9]。

miR-155是與免疫密切相關的多功能基因，廣泛參與機體炎癥反應、免疫排斥等多個生物過程。多個研究表明miR-155在移植物抗宿主病[10]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[11]、類風濕關節(jié)炎[12]等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，有望成為新的治療靶點[13-14]。

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是機體免疫反應的起始細胞，有不依賴于MHC Ⅱ類分子途徑的抗原識別能力，在移植物抗宿主免疫、自身免疫耐受等免疫反應中發(fā)揮關鍵作用[15-17]。有研究表明MSC可以通過抑制DC成熟和遷移發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[18-19]。通過誘導DC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，與MSC對T細胞直接作用相比較，或許有更好的臨床應用價值。作為免疫調(diào)節(jié)的效應細胞，T細胞介導細胞毒性與局部炎癥相關的免疫應答，在對抗腫瘤的免疫反應中起著非常重要的作用。選擇性地調(diào)節(jié)T細胞水平，通過逆轉(zhuǎn)疾病過程中T細胞的漂移狀態(tài)，達到治療某些疾病的目的，具有一定的臨床應用價值[20-21]。本實驗旨在通過誘導DC途徑，探索miR-155基因修飾后的骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSC）對免疫調(diào)節(jié)的影響，為BMSC的臨床應用提供新的方向和思路。

材料與方法

一、主要材料

SPF 級健康 2 ～ 3 周和 7 ～ 8 周雌性 C57BL/6小鼠，購買于昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒及Trizol試劑購于美國Sigma公司；Murine GM-CSF購于美國Peprotech公司，RMPI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；紅細胞裂解液，購于中國碧云天公司；Transwell小室，購于美國Corning公司。FITC-抗小鼠 CD90、PE-抗小鼠 CD105、PE-抗小鼠CD73、APC-抗小鼠CD44、APC-抗小鼠CD31、FITC-抗小鼠CD45、FITC-抗小鼠CD4，IFN購于美國Biolegend公司。microRNA（序列如表1）、PCR引物由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

表1 人工合成microRNA序列

二、實驗方法

1.MSC的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染效率和miRNA-155表達量檢測：該部分實驗分為Control組（不轉(zhuǎn)染對照組）、agomir NC-Fam組（觀察轉(zhuǎn)染效率的熒光組）、miR-155-agomir NC組（高表達組的對照組）、miR-155-agomir組（高表達組 )、miR-155-antagomir NC組（抑制表達組的對照組）、miR-155-antagomir組（抑制表達組）。從2 ～ 3周小鼠骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，流式細胞儀檢測其表面標志CD90、CD105、CD73、CD31和CD45以鑒定獲得培養(yǎng)的P3 代 BMSCs。4 μl Lipofectamine 2 000 和 4 μl miRNA分別稀釋于200 μl DMEM/F12不完全培養(yǎng)基中孵育5 min；將miRNA稀釋液緩慢加入Lipofectamine 2000稀釋液中，室溫孵育10 min。6孔板用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基換液（600 μl/孔），分別加入400 μl Lipofectamine 2000/siRNA復合物400 μl。轉(zhuǎn)染 6 h后，換液為 DMEM/F12完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察Fam組綠色熒光初步判斷轉(zhuǎn)染效率，流式細胞檢測技術進一步確定轉(zhuǎn)染效率，實時熒光定量PCR儀檢測各個組miR-155的表達量，反應體系如表2所示。

2.DC的獲取、培養(yǎng)和遷移實驗：該部分實驗分為 DC only組、MSCs組（不轉(zhuǎn)染組）、miR-155-agomir組（高 表 達 組）、miR-155-agomir NC 組（高表達組的對照組）、miR-155-antagomir組（抑制表達組）、miR-155-antagomir NC組（抑制表達組的對照組）。獲取DC：無菌條件下取4只7 ～ 8周C57BL/6小鼠雙側(cè)股骨，沖洗骨髓得到的細胞懸液通過 40 μm 濾網(wǎng)過濾后，300×g離心 5 min，棄上清液，3 ml紅細胞裂解液重懸沉淀，室溫下反應2 min，加入含有5﹪血清的RMPI-1640 15 ml終止反應，300×g離心 5 min，棄上清液，1×PBS重懸離心洗滌細胞3遍，配置好的DC培養(yǎng)液（RMPI-1640+10 ﹪ FBS+1 ﹪ Glutamine+50 μmol/L β-巰基乙醇+40 ng/ ml GM-CSF）[22]重懸沉淀并接種于3 個6 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃、5﹪CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，選用培養(yǎng)3 d的細胞。Transwell小室中將microRNA轉(zhuǎn)染的BMSC與DC共培養(yǎng)48 h后，（1）通過標記DC的成熟相關的表面標志MHCⅡ、CD40和CD86的表達水平，判斷DC的成熟度；（2）將共培養(yǎng)的DC細胞放入Transwell的上層小室，ATP溶液放入下層小室，12 h觀察DC向ATP溶液的遷移情況。棉簽涂抹去上層未遷移細胞，保留遷移的DC，DAPI染色10min后，倒置熒光顯微鏡下計數(shù)并統(tǒng)計；（3）提取DC的總蛋白，Western Blot法以GAPDH為內(nèi)參，檢測AKT、NF-κβ信號通路蛋白表達情況，探索影響機制。

表2 實時熒光定量PCR體系

3.T細胞增殖檢測：脾臟來源單個核細胞的獲取，無菌條件下取3只7 ～ 8周C57BL/6小鼠的脾臟，研磨脾臟獲得細胞懸液，40 μm濾網(wǎng)過濾，經(jīng)紅細胞裂解液裂解后獲得單個核細胞懸液。在Transwell小室中將經(jīng)BMSC誘導后的DC與脾臟來源的細胞共培養(yǎng)72 h后，流式細胞檢測共培養(yǎng)后T細胞增殖能力。初步探索誘導后的DC對T細胞影響。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用± s表示。miR-155表達水平的組間差異和DC遷移能力組間差異以One-way ANOVA進行比較分析；DC表面標志和NF-κB，AKT信號通路蛋白兩組間差異以t檢驗統(tǒng)計分析，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染效率及miR-155表達水平

首先將分離培養(yǎng)的P3代BMSCs進行表型的鑒定，結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的BMSC為CD90、CD105、CD73、CD44陽 性，CD31和 CD45陰 性（圖1），符合BMSCs的表型特征。應用Lip2000對BMSC進行轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染BMSC 24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功的BMSC為亮綠色，流式細胞計數(shù)Fam熒光提示轉(zhuǎn)染效率為100﹪（圖2、3），實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-155的表達量，miR-155 agomir組miR-155表達水平較對照組升高了10 000倍，miR-155antagomir組miR-155的表達水平較對照組下降（表3）。

表3 轉(zhuǎn)染后miR-155表達結(jié)果（± s）

表3 轉(zhuǎn)染后miR-155表達結(jié)果（± s）

注：F=446.077，P＜0.001；與control組比較，aP＜0.05；與miR-155 agomir NC組比較，bP＜0.05；與miR-155 antagomirNC組比較，cP＜0.05

分組 樣品數(shù) miR-155表達水平control組 3 1.19± 0.19 miR-155 agomir NC組 3 2.95± 0.30 miR-155 agomir組 3 12219.51± 1001.83ab miR-155 antagomir NC組 3 6.01± 0.45 miR-155 antagomir組 3 2.54± 0.80c

二、DC表型、遷移能力檢測及其機制探索

在Transwell小室中，轉(zhuǎn)染后的BMSC誘導DC 48 h后，進行 MHC Ⅱ，CD40，CD86的流式檢測（圖4），以明確誘導過程對DC免疫成熟度的影響，檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-155后的BMSC與DC共培養(yǎng)后，DC表面標志CD40陽性率從100﹪下降至85﹪（t=33.71，P＜ 0.05），CD86從 100﹪下降至 75﹪（t=57.00，P＜ 0.05），即減少了DC的成熟度（表4）；DAPI核染遷移后的DC細胞，倒置熒光顯微鏡下計數(shù)并統(tǒng)計（圖5），高表達miR-155組DC遷移能力降低（t=7.35，P＜ 0.05），抑制 miR-155 表達組，DC 遷移能力增加（表5）。Western Blot檢測其信號通路蛋白表達情況（圖6），miR-155 agomir組AKT信號通路蛋白相對表達下降（t=22.21，P＜ 0.05），NF-κβ通路蛋白相對表達降低（t=23.32，P＜ 0.05，表 6）。

三、miR-155高表達降低T細胞增殖能力

圖1 BMSC表型的鑒定

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞（×100）

圖3 流式細胞檢測Fam組熒光提示轉(zhuǎn)染效率為100﹪

經(jīng)誘導后的DC與脾臟來源T細胞共培養(yǎng)72h后，流式細胞術檢測各組T細胞增殖能力，結(jié)果顯示miR-155 agomir組T細胞增殖能力相對減弱，miR-155 antagomir組T細胞增殖能力相對增強（圖 7）。

表4 DC表面標志表達結(jié)果（﹪， ± s）

表4 DC表面標志表達結(jié)果（﹪， ± s）

表面標志 轉(zhuǎn)染前 轉(zhuǎn)染后 t值 P值MHC II 99.57±0.39 97.96±0.57 2.224 0.09 CD40 99.69±034 85.18±0.66 33.710 ＜0.001 CD86 99.58±0.45 75.26±0.64 57.000 ＜0.001

表5 Transwell小室中遷移DC數(shù)目（個， ± s）

表5 Transwell小室中遷移DC數(shù)目（個， ± s）

注：F=61.179，P＜ 0.001與 control組比較，aP ＜ 0.05；與 miR-155 agomir NC 組比較，bP ＜ 0.05；與 miR-155 antagomirNC組比較，cP ＜0.05

分組 樣本數(shù) 遷移DC的數(shù)目control組 5 40.00±3.54 MSCs組 5 27.00±1.58a miR-155 agomir NC組 5 27.00±1.58 miR-155 agomir組 5 18.00±2.24b miR-155 antagomir NC組 5 30.00±0.71 miR-155 antagomir組 5 35.00±2.24c

表6 AKT和NF-κβ信號通路蛋白相對表達情況結(jié)果（ ± s）

表6 AKT和NF-κβ信號通路蛋白相對表達情況結(jié)果（ ± s）

注：與DC only組比較，aP ＜ 0.05；與miR-155 agomir NC組比較，bP＜ 0.05；與 miR-155 antagomir NC 組比較，cP ＜ 0.05

分組 樣本數(shù) AKT NF-κβ DC only 3 0.64±0.00 0.60±0.01 miR-155 agomir NC 3 0.65±0.02 0.48±0.01 miR-155 agomir 3 0.33±0.02ab 0.31±0.01ab miR-155 antagomir NC 3 0.55±0.04 0.49±0.02 miR-155 antagomir 3 0.62±0.01c 0.51±0.00c F值 134.047 230.5 P值 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001

圖4 轉(zhuǎn)染前后DC表面標志表達情況

圖5 倒置相差顯微鏡下觀察DC遷移能力（×100）

圖6 Western Blot檢測信號通路蛋白表達情況

討 論

圖7 流式細胞檢測T細胞增殖能力

BMSC作為獲取最便捷的干細胞，除了用于組織修復外，還具有免疫調(diào)節(jié)、誘導免疫耐受等功能，且廣泛應用于移植物抗宿主病、類風濕關節(jié)炎等疾病的治療[23-24]。但是，干細胞注射治療存在移植細胞數(shù)量巨大、作用機制不明確等問題，限制了它的臨床應用，許多學者考慮對其進行特異性干預以適應臨床應用，其中有學者對JAM-A、OX40Ig、MicroRNA Let-7a等位點進行基因修飾[6,25-26]，經(jīng)過修飾的MSC均有更好的臨床應用價值。前期實驗發(fā)現(xiàn)，在大鼠同種異體心臟移植模型中，受體miR- 155表達水平增高，但是經(jīng)過BMSC誘導免疫耐受后，miR-155表達水平下降，即注射BMSC能逆轉(zhuǎn)miR-155的表達[9]，這說明miR- 155在MSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)中或許起著重要作用。有研究報道m(xù)iR-155在類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎等許多自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，眾多研究表明其可能是潛在的治療靶點[27-29]。另外，DC是人體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞，是免疫反應的啟動者，MSC的培養(yǎng)上清可抑制DC中TLR（Toll樣受體）3和TLR9的表達[18]，與MSC共培養(yǎng)的DC可抑制CD4+T細胞增殖[17]，相比較于BMSC與T細胞直接作用，通過DC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)這一途徑或許有更好的臨床應用前景。

本研究探究miR-155修飾后的BMSC通過DC這一途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究成功構建了不同miR-155表達水平的BMSC。將預處理的BMSC與骨髓來源的DC細胞進行共培養(yǎng)，對DC進行誘導。轉(zhuǎn)染后BMSC誘導DC結(jié)果說明了，miR-155的高表達有助于抑制DC表面分子CD40和CD86的表達，即抑制了DC的成熟，并且miR- 155agomir組DC可以減少DC的遷移，WB結(jié)果顯示miR-155的高表達可能通過阻斷AKT和NF-κβ途徑誘導耐受性DC的形成。誘導后DC與T細胞共培養(yǎng)的結(jié)果提示，高表達miR- 155可以減少T細胞增殖能力。本研究結(jié)果表明miR-155的高表達可擴大BMSC的免疫調(diào)節(jié)作用，為以后進一步發(fā)揮BMSC免疫調(diào)節(jié)能力提供了一個方向，為臨床應用BMSC誘導免疫耐受和治療自身免疫性疾病提供一個思路。

綜上所述，本研究證明了特異性調(diào)控BMSC的miR-155表達水平后，不同miR-155表達水平對BMSC免疫調(diào)節(jié)能力的影響，可以通過誘導DC這一途徑實現(xiàn)。高表達miR-155的BMSC可通過抑制NF-κβ和AKT途徑誘導耐受性DC形成，通過對T細胞增殖能力的檢測，明確miR-155的高表達可加強BMSC的免疫調(diào)節(jié)能力。在臨床應用中，一方面或許可以提高治療移植物抗宿主病、類風濕關節(jié)炎、克羅恩病等自身免疫性疾病的效果，另一方面可能減少干細胞注射劑量，大大降低大劑量注射干細胞產(chǎn)生副作用。為擴大BMSC的臨床應用提供了一個思路。

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