環(huán)狀RNA與心血管疾病

，，2*

(1.中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙410078；2.心血管研究湖南省重點實驗室)

1976年首次發(fā)現，一些植物的類病毒由單鏈共價閉合的RNA分子構成[1]，提示存在環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)。隨后Hsu等[2]在電子顯微鏡下觀察到人HeLa細胞質中也存在circRNA。由于circRNA的表達量很低，一度被視為是RNA異常剪接的產物，沒有受到重視。直到陸續(xù)發(fā)現circRNA廣泛存在于各種不同的后生動物(例如人、小鼠、斑馬魚、線蟲、果蠅以及植物)[3]，才逐漸意識到其可能具有重要的生理功能。circRNA在不同的組織器官中均有分布，十分穩(wěn)定，不易降解，在進化過程中保守性強[4]。circRNA在基因表達調控方面發(fā)揮著重要作用，也是人類疾病的重要標志物。

1 circRNA概述

circRNA是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴，由共價鍵形成閉環(huán)結構的RNA分子[5]。經典的RNA檢測方法只能分離具有多聚腺苷酸尾(polyA)結構的線性RNA分子[6]。不同于線性RNA分子，circRNA不具有poly(A)尾巴，長久以來大多數circRNA都隱藏在轉錄組多聚腺苷酸化RNA分析的“雷達偵測”之下[7]。近來，為了在基因組水平鑒定circRNA，研究者提取總RNA之后，同時去除核糖體RNA和線性RNA，富集circRNA進行測序，從而檢測到更多種類的circRNA。circRNA的調控作用貫穿基因調控的全過程，從mRNA轉錄、剪接到RNA降解和翻譯。目前應用最廣泛的篩選circRNA的方法主要有2種，包括高通量測序和芯片分析。

2 circRNA的生物合成與分類

circRNA由線性RNA反向剪接而來，主要來自蛋白質編碼基因的外顯子，也可由內含子區(qū)、非翻譯區(qū)、基因間的基因座和已知轉錄本的反義序列得來[7]。

根據其來源主要分為3類：

(1)外顯子環(huán)狀RNA(Exonic circRNAs，ecircRNA)。Jeck等人[4]提出ecircRNA主要通過兩種模式形成：第1種是套索驅動環(huán)化，通過外顯子跳讀所介導。第2種是內含子配對驅動環(huán)化，直接反向剪接而來。在此機制中，外顯子上下游的側翼內含子序列中包含反向重復ALU元件，介導ecircRNA的形成[8]。除了ALU元件之外，成環(huán)外顯子側翼內含子序列中還富集著反向互補配對序列(reverse complementary matches,RCMs)，影響circRNA的產生，雙鏈RNA蛋白酶參與該過程，并且敲低基因編輯基因ADAR(adenosine deaminases acting on RNA)1后，ecircRNA的表達顯著增加[5]。

此外，RNA結合蛋白也可介導ecircRNA的形成。 RBM20是一種RNA結合蛋白，可涉及多種心臟特異性基因的編輯過程，包括Titin基因。Titin基因的I-band區(qū)可形成許多ecircRNA，其中一些ecircRNA可以動態(tài)調控擴張型心肌病， RBM20突變會影響該區(qū)域ecircRNA的形成，誘導心肌病的發(fā)生[9]。 RNA結合蛋白FUS參與RNA的許多生物合成過程，可以與ecircRNA反向剪接位點兩側的內含子結合，調控ecircRNA的產生[10]。

(2)外顯子-內含子環(huán)狀RNA(exonic-introniccircRNA，EIcircRNA)。EIcircRNA與ecircRNA的形成機制相同，外顯子成環(huán)后，還有內含子保留在外顯子之間，這樣的circRNA被稱為 EIcircRNA。 EIcircRNA主要在細胞核內與U1snRNP相互作用，順式調控其親本基因的轉錄[11]。

(3)內含子環(huán)狀RNA (circular intronic RNA，ciRNA)。CiRNA僅僅由內含子組成，其生物合成依賴于一個共有基序，該基序包括5′剪接位點附近的一個7nt的富含GU的元件和分支點附近的一個11nt的富含C端的元件。大多數ciRNA存在于細胞核內，與細胞質circRNA有不同的作用方式。CiRNA不與miRNA結合發(fā)揮“海綿作用”，但也會影響基因的轉錄過程。如基因ankrd52的內含子形成ci-ankrd52，大量富集于ankrd52的轉錄起始位點，正向調控RNA聚合酶II的功能，有效促進ankrd52的轉錄[12]。

3 circRNAs的作用機制

3.1充當“miRNA海綿” microRNAs(miRNA)是小非編碼RNA分子，一般長度為20～25 nt，通過介導靶基因降解或限制靶基因翻譯，從而抑制靶蛋白的表達[13]。circRNA可發(fā)揮競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，CeRNA)作用，競爭性結合miRNA，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，反過來促進靶基因的表達[14-15]。因此，miRNA分子海綿作用是circRNA最重要的作用機制之一[16-19]。circRNA與mRNA在細胞質中競爭性與miRNA結合，影響基因的調控[4]。

CiRS-7/CDR1as是小腦退行性相關肽(CDR1)基因的反義轉錄本[20]，與miR-7(包括miR-7a和miR-7b)有超過70個保守結合位點，可作為分子海綿有效抑制miR-7活性。CiRS-7/CDR1as穩(wěn)定富集在細胞質中，導致miR-7不能作用于靶基因，使靶基因表達水平增高[17]。除了ciRS-7，還有一些circRNA可作為有效的“miRNA海綿”，如circ-SRY與miR-138在小鼠有18個結合位點，可是兩者在人體中卻不結合[16]。此外，在食管鱗癌組織中，circ-ITCH可以與親本基因ITCH競爭性結合miR-214、miR-7和miR-20a，促進其靶基因ITCH的表達[21]。circ-HIPK3來源于HIPK3基因的2號外顯子，與9個不同的miRNA共有18個結合位點，能抑制多個miRNA的活性來調控細胞增殖[22]。

3.2調控基因轉錄盡管大多數circRNA存在于細胞質，部分circRNA在細胞核內也能檢測到。RNA ciankrd52，ci-mcm5和ci-sirt7在細胞核內聚集不含有miRNA反應元件。敲低豐度最高的ci-ankrd52導致線性mRNA ankrd52顯著下調，但對其他上游和下游基因沒有影響，表明ciRNA順式調控其親本基因的表達。CiRNAs和Pol II的延伸復合物之間存在相互作用，這可能是ciRNAs調控基因轉錄的潛在機制[12]。

circRNA調控基因轉錄的另一個機制是與U1snRNP直接且穩(wěn)定地相互作用[23]。在EIciRNA中，保存的內含子有一個U1snRNP結合位點。使用RNA-DNA雙熒光原位雜交發(fā)現EIciRNA，U1 snRNP，Pol II和宿主基因啟動子之間存在多重相互作用。盡管circRNA會干擾其同源線性mRNA的形成，一旦生成EIciRNA，它們可以反過來增加自身以及相應線性轉錄本的表達[11]。

3.3調控蛋白質生成circRNA可以與Pol II和AGO蛋白相互作用，充當蛋白調控者，影響蛋白質的定位、種類和儲存RNA結合蛋白(RNA binding proteins， RBP)[24]。circMbl擁有剪切因子muscleblind(MBL)結合位點，通過與MBL結合反過來調控circMbl的形成，這是一種復雜的蛋白質自身調節(jié)機制[25]。circ-Foxo3能與蛋白質CDK2 和P21結合，形成三元復合體，調控細胞周期進程[26]。

3.4翻譯蛋白質circRNA自被發(fā)現以來一直被定義為非編碼RNA。事實上，大多數circRNA來源于蛋白編碼序列和開放閱讀框，并且存在于細胞質中，因此早有研究者懷疑circRNA可能翻譯蛋白質。1995年就有文獻報道，某些circRNA擁有內部核糖體插入位點(internal ribosome entry site，IRES)，可以進行翻譯[27]。構建一個包含IRES的circRNA轉染到細胞中，可以翻譯出功能性蛋白質[28]。circ-FBXW7是抑癌基因FBXW7的第 3、4 外顯子環(huán)化形成的一個circRNA，可翻譯一個185氨基酸大小的蛋白質-FBXW7-185aa。FBXW7通過泛素化途徑調控原癌基因c-Myc的穩(wěn)定性，而FBXW7-185aa可以協同母基因FBXW7，降低c-Myc的蛋白表達，促進c-Myc的泛素化降解，從而抑制膠質瘤的發(fā)生[29]。這些研究打破了“circRNA屬于非編碼RNA”的傳統(tǒng)認識。

最近有研究表明，circRNA即使沒有IRES和翻譯時所需的特定序列(“帽子”結構和poly-A“尾巴”)，也能翻譯成蛋白質[30]。然而，外源性circRNA可以進行翻譯，卻還沒有證據表明內源性circRNA也能進行翻譯。

3.5調控蛋白質翻譯一些ecircRNA有翻譯起始密碼子序列，使得線性轉錄本不能產生蛋白質，導致終產物表達下調。這種調控作用成為“基因陷阱”(mRNA traps)，即circRNA調控蛋白質的翻譯不是通過自身翻譯蛋白質，而是經由阻斷其他蛋白質的形成。在人成纖維細胞中，34%單個環(huán)狀外顯子包含起始密碼子，表明circRNA作為“基因陷阱”的廣泛作用[24]。

4 circRNA與心血管疾病

心血管疾病時circRNA變化情況如表1所示。對circRNA在心血管疾病中的作用的了解還很有限，研究其在心血管疾病中的作用可能揭示新的發(fā)病機制，繼而發(fā)現治療心血管疾病的新策略。

Wilson等[39]對14例人類心臟組織，25例小鼠心臟組織以及28天時間序列跨度的人類胚胎干細胞分化的心肌組織中的circRNA進行了RNA深度測序，分別在人和小鼠中發(fā)現了15 318個和3 017個心臟circRNA。這些circRNA的表達量與其同源線性RNA的表達量一致，含量最高的circRNA所對應的基因也是心肌組織特異性的基因，比如titin，RYR2和DMD基因。含量最豐富的circRNA為circSLC8A1-1。Titin基因對應高達402種不同的circRNA。心血管系統(tǒng)中的circRNA及其功能如表2所示。

表1 心血管疾病時環(huán)狀RNA變化情況

4.1 circRNA與心肌梗死在心肌梗死小鼠心肌或低氧處理的心肌細胞中， Cdr1as和miR-7a均上調[40]。 Cdr1a在小鼠心肌細胞中過表達促進細胞凋亡，然而miR-7a過表達可逆轉此過程[40]。特異性蛋白1(Specific protein 1，SP1)和聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)都是miR-7a的靶點，而PARP和SP1過表達可以抑制缺氧條件下miR-7a誘導的細胞凋亡減少[40]。此外，Cdr1as在體內過表達增加了心肌梗死面積，PARP和SP1的表達也上調，然而miR-7a過表達能逆轉這些變化[40]。

表2 心血管系統(tǒng)中的circRNA及其功能

circRNA是共價閉合環(huán)狀結構，比其線性轉錄本更加穩(wěn)定。由于缺乏自由端，circRNA能抵抗RNA核酸外切酶和RNase R，不易降解，可作為疾病診斷的標志物。Vausort等[41]檢測了急性心肌梗死患者和健康人外周血中circRNA，通過生物信息學分析，確定了一種心肌梗死相關的circRNA-MICRA(myocardial infarction-associated circular RNA)。MICAR主要由染色體15q22上的鋅指蛋白609(ZNF609)基因的外顯子1形成，長874 nt。心肌梗死患者外周血中MICRA的表達水平比健康人明顯要低。MICRA水平較低的患者發(fā)生左心室功能障礙的風險比較高，提示MICRA是左心室功能障礙有力的預測指標。

4.2 circRNA與心衰miR-223是心肌肥大的陽性調節(jié)因子。含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with CARD，ARC)是miR-223的下游靶點；ARC轉基因小鼠心肌肥大反應降低。心臟相關環(huán)狀RNA(heart related circular RNA，HRCR)是最近報道的一種心臟circRNA，充當miR-223“海綿”，直接結合miR-223，抑制miR-223活性，從而增加ARC表達[43]。HRCR在心肌細胞和小鼠過表達均呈現減弱的心肌肥大反應。這些發(fā)現揭示了一個由circHRCR、miR-223和ARC組成的新的心臟肥大/心衰調控通路和治療靶標[43]。

Werfel等[55]用去除核糖體RNA的方法建庫進行RNA測序，分析了人、小鼠和大鼠不同發(fā)育階段或生理病理狀態(tài)下心臟circRNA的表達情況，發(fā)現人類心肌組織中circRNA的總體表達量要比大鼠和小鼠高。大鼠分為新出生大鼠組和成年大鼠組，兩組間Slc8a1、Ttn、Eya3、Scmh1等基因對應的circRNA表達有顯著差異。人和小鼠分為心衰組和非心衰組，研究發(fā)現兩物種心衰組circRNA的數目與種類均高于非心衰組，例如Slc8a1和Ttn基因對應的circRNA在心衰組表達顯著增加。特別地，蘭尼堿受體2(ryanodine receptor 2，RYR2)基因存在于人的心臟組織中，對應的circRNA亞型超過100種?？傊琧ircRNA與心臟生理病理過程密切相關，尤其是幾個差異表達的circRNA分子對應的基因如Slc8a1、Ttn、RYR2、Eya3等，可作為進一步研究心衰的理想候選基因。

4.3 circRNA與動脈粥樣硬化動脈粥樣硬化的易感性與INK4/ARF基因座附近的染色體9p21.3 單核苷酸多態(tài)性相關，而 INK4/ARF基因的表達能夠被多梳家族蛋白(Polycomb-group proteins，PcG)所抑制。cANRIL是INK4/ARF的環(huán)狀反義轉錄物，染色體 9p21.3 對動脈粥樣硬化易感性的影響主要通過cANRIL對PcG特異性的募集所實現[44]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)ANRIL(CDKN2B-AS1)位于9號染色體短臂p21區(qū)域(9p21)，這個區(qū)域是人類動脈粥樣硬化疾病相關的重要基因座[56]。LncANRIL表達增加導致動脈粥樣硬化易感[57]，而線性linANRIL可以形成circRNA。進一步研究發(fā)現ANRIL基因外顯子形成的circRNA形式多樣，其中外顯子5、6、7所形成的circRNA表達量最高，研究者將該circRNA定義為cANRIL[45]。核糖體生物合成因子PES1(pescadillo homologue 1)在核仁中參與60S核糖體亞基的組裝合成過程[58]。cANRIL結合PES1的C-末端富含賴氨酸的結構域，從而損害血管平滑肌細胞和巨噬細胞中核酸外切酶介導的前體rRNA加工和核糖體生物發(fā)生。circANRIL誘導核仁應激和p53激活，導致人血管平滑肌細胞凋亡，抑制細胞增殖，這是動脈粥樣硬化的關鍵細胞功能。這些發(fā)現表明，circANRIL參與調控核糖體的生物合成，在動脈粥樣硬化中起關鍵作用[45]。

4.4 circRNA與冠心病趙振舟等[34]芯片篩選冠心病患者和健康人外周血中差異表達的circRNA，發(fā)現兩組共有22個circRNA有差異性表達，其中在冠心病患者血液中表達上調的有12個，表達下調的有10個。進一步研究發(fā)現hsa_circ_0124644在冠心病患者外周血中特異性和敏感度相對較高，可作為冠心病的診斷標志物。

4.5 circRNA與糖尿病心肌病糖尿病引起心肌結構和功能改變，心臟肥大和心肌纖維化[59-60]。唐春梅等[32]用circRNA芯片檢測糖尿病小鼠心肌組織中circRNA的表達譜，共發(fā)現76個circRNAs表達有顯著差異，其中45個表達上調，31個表達下調。研究者選取了表達顯著上調的circRNA_000203進行研究，發(fā)現circRNA_000203與miR-26b-5p有兩個結合位點，在心肌成纖維細胞中過表達circRNA_000203，引起miR-26b-5p的下游靶點纖維化相關基因Col1a2和CTGF的表達上調，纖維細胞標志物α-SMA的表達也增加，提示circRNA_000203能促進心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化。因此，circRNA_000203也許是糖尿病心肌病心肌纖維化的治療新靶點。

5 展 望

心血管疾病是全球死亡率最高的疾病，其治療與預后是一個重大難題。除了常規(guī)的治療方式，目前基于基因的診療技術為治療心血管疾病提供了新視角。采用疾病特異性相關的反義miRNA分子來抑制疾病，已進入臨床試驗階段。在分子水平上，對miRNA的反義核苷酸鏈進行化學修飾可提高miRNA與細胞的親和力，使其更有效地到達治療靶點。而LNA-GapmeRs技術直接靶向lncRNA，與目標lncRNA結合后可迅速激活核糖核酸內切酶(RNase H)，降解lncRNA。

不同于miRNA和lncRNA，circRNA能抗核酸外切酶從而可在體內穩(wěn)定存在，因此更具有潛力成為基因治療的新工具。circRNA可充當“分子海綿”，與某個特定的miRNA結合，從而抑制靶基因的表達。已有報道證實在體外人工合成的circRNA分子可靶向與丙型肝炎病毒密切相關的miR-122，進而抑制丙型肝炎病毒復制和病毒蛋白的形成，緩解疾病進展[61]。circRNA還可通過調控基因表達，蛋白質翻譯和生成等機制發(fā)揮作用。因此人工合成的circRNA也可能以靶基因或蛋白質為靶點，直接作用于疾病。近年來亦有研究發(fā)現一些circRNA可通過不同途徑調控心血管疾病的相關信號通路，還有許多circRNA在心血管疾病的血漿、組織與細胞中表達差異較大，這些circRNA也可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。然而，現在對circRNA生物學功能的研究還有待深入，對其生物合成和降解過程也了解有限。進一步理解circRNA在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制，有助于人們更好地開發(fā)出基于circRNA的診斷和治療工具。

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