布洛芬對少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長發(fā)育的影響

江繼鵬，楊凱，趙飛，張珊珊，逄璦博，張賽△，陳旭義△

少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的支持細(xì)胞，在軸突包繞、髓鞘絕緣結(jié)構(gòu)形成、協(xié)助興奮傳遞、維持保護(hù)神經(jīng)元正常代謝等方面發(fā)揮決定性的作用［1-2］。OLs功能不良或發(fā)生病變時(shí)，可能發(fā)生嚴(yán)重的脫髓鞘疾病，其中以多發(fā)性硬化癥（MS）為代表的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病已經(jīng)成為困擾人類健康的一類頑疾［3］，其發(fā)病的年輕化、病情的反復(fù)性、治療策略的單一性及預(yù)后的不確定性給患者及其家庭帶來極大的痛苦［4］。目前該類疾病的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，相關(guān)治療進(jìn)展依舊緩慢，臨床診療主要以控制急性發(fā)作、延緩疾病加重、促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元軸突再生及髓鞘化為主要思路，常用的藥物如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的不良反應(yīng)是傳統(tǒng)療法存在爭議的一大原因［5］，而新興的治療策略如干細(xì)胞療法等仍存在較多的不確定性。因此，尋找新的、安全有效的替代藥物保護(hù)內(nèi)源性的、幼稚的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（oligodendroglial precursor cells，OPCs）及成熟的OLs是目前治療脫髓鞘疾病的一個(gè)新課題。

布洛芬作為一種非甾體抗炎藥已被廣泛應(yīng)用于臨床鎮(zhèn)痛治療。近年來研究顯示，布洛芬可通過抑制環(huán)氧化酶等途徑控制出血性腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的死亡，減少腦白質(zhì)損傷，促進(jìn)早期髓鞘的形成［6］。本文主要研究布洛芬對OPCs的促成熟作用及對OPCs和OLs的保護(hù)作用，旨在為下一步脫髓鞘疾病的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供更多的可能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級健康成年雌性SD大鼠6只，體質(zhì)量200～250 g；新生SD大鼠（出生24～48 h）6只，均購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要藥品及試劑 布洛芬、油脂酰溶血磷脂酸（北京阿拉丁公司），DMEM/F12型培養(yǎng)基（美國HyClone公司），兔抗大鼠血小板衍生生長因子受體-α抗體（PDGFR-α，美國SCB公司），羊抗大鼠髓鞘堿性蛋白抗體（MBP，美國Abcam公司）。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082（美國耐普克公司），高溫高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750L-PC（日本Sanyo公司），相差倒置熒光顯微鏡CKX41-A22PHP（日本奧林巴斯公司），顯微手術(shù)器械（蘇州施強(qiáng)公司），手術(shù)解剖顯微鏡M844F40（瑞士徠卡公司），微量電子稱TP-202（貴州電子衡器公司），高速細(xì)胞離心機(jī)5702R（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞獲取及分組干預(yù) 對6只成年SD大鼠提取OLs進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，并對6只新生大鼠提取腦皮質(zhì)獲取混合膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)分離、擴(kuò)增，傳代獲得一定數(shù)量的OPCs，分別對獲取的OLs和OPCs進(jìn)行免疫熒光染色。用溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）干預(yù)成年SD大鼠的OLs，并觀察干預(yù)前后OLs形態(tài)學(xué)變化。將OPCs接種于24個(gè)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、布洛芬組、LPA組及LPA+布洛芬組，每組6個(gè)培養(yǎng)板。待各組細(xì)胞貼壁第3天，觀察細(xì)胞形態(tài)并加入藥物干預(yù)，對照組加入生理鹽水，其他3組分別加入布洛芬鹽水溶液（100μmol/L）、LPA（1μmol/L）及兩者的混合液各1 mL。藥物干預(yù)持續(xù)7 d后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，比較各組OLs生成情況并進(jìn)行成熟OLs細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 OPCs及OLs的免疫熒光染色鑒別 吸管吸取細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞層3次，應(yīng)用4%多聚甲醛1 mL固定細(xì)胞30 min，每個(gè)孔再次用PBS液清洗3次，使用聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）浸沒培養(yǎng)皿10 min后用PBS清洗3次，吸取1 mL BSA封閉液封閉細(xì)胞膜表面15 min后分別加入PDGFR-α（1∶200）和MBP（1∶200）一抗37～40 ℃下反應(yīng)30 min，4℃下孵育過夜后吸取多余一抗，PBS沖洗3次，分別加入熒光二抗（鼠抗兔和鼠抗羊IgG熒光抗體），37℃下放置1 h，緩沖液搖洗3次（60 r/min），濾紙吸干蓋玻片，加入DAPI（1∶100）靜置10 min。然后利用緩沖液搖洗3次，3～5 min/次。封片后在相差倒置熒光顯微鏡下（200倍）觀察PDGFR-α、MBP熒光染色情況。

1.2.3 LPA干預(yù)前后OLs形態(tài)學(xué)觀察 用光學(xué)顯微鏡（400倍）觀察獲取的大鼠成熟OLs的細(xì)胞形態(tài)，在OLs培養(yǎng)皿中加入1 mL LPA（1.0μmol），2 h后觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，進(jìn)行干預(yù)前后的比較。

1.2.4 藥物干預(yù)前后各組OPCs的形態(tài)學(xué)觀察 將獲取的新生鼠的OPCs擴(kuò)增培養(yǎng)后以6.7×104/cm2接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁3 d后在光鏡下（200倍）觀察各組細(xì)胞形態(tài)，分別對各組進(jìn)行相對應(yīng)的藥物干預(yù)，持續(xù)7 d后，光鏡下（200倍）觀察細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行干預(yù)前后的比較。

1.2.5 免疫熒光染色觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù) 持續(xù)干預(yù)7 d后，進(jìn)行MBP免疫熒光染色（染色過程重復(fù)1.2.2中的操作步驟），觀察各組OPCs的生長發(fā)育情況和MBP陽性細(xì)胞數(shù)量，每組隨機(jī)取20個(gè)孔。應(yīng)用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6 Western blot法檢測MBP的表達(dá) 藥物持續(xù)干預(yù)7 d后，取細(xì)胞培養(yǎng)液以10 000 r/min離心10 min，取上清分裝。用BCA蛋白含量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白終濃度為3 g/L，-80℃保存。每組按30μg/孔上樣，行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將電泳儀電壓調(diào)至80 V，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后調(diào)整指示電壓至110 V，濕法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%牛血清白蛋白封閉，加入一抗（羊抗大鼠MBP抗體1∶10 000和兔抗大鼠GAPDH抗體1∶10 000）室溫孵育1 h，4 ℃過夜，二抗（HRP-兔抗羊1∶2 000和HRP-羊抗兔1∶20 000）室溫孵育1 h，用TBST在震蕩器上洗3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒曝光顯影，凝膠成像儀獲取圖像，使用Scion Image軟件分析計(jì)算相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用析因設(shè)計(jì)進(jìn)行單個(gè)因素主效應(yīng)及雙因素交互效應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPCs及OLs的免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光染色后PDGFR-α陽性的OPCs胞質(zhì)呈紅色，胞核呈藍(lán)色；MBP陽性的OLs胞質(zhì)和突起呈綠色，胞核呈藍(lán)色。見圖1。

Fig.1 Immunofluorescencestainingof OPCsand OLs(×200)圖1 OPCs及OLs免疫熒光染色（×200）

2.2 LPA干預(yù)前后OLs的形態(tài)比較 LPA作用于成熟OLs后可見呈“蜘蛛網(wǎng)狀”生長的突起自末端向胞體方向萎縮，細(xì)胞間致密的網(wǎng)狀連接變得十分稀疏。見圖2。

Fig.2 Morphological comparison of OLsbefore and after LPA treatment(×400)圖2 LPA干預(yù)前后OLs的形態(tài)比較（×400）

2.3 藥物干預(yù)前后各組OPCs細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 各組在OPCs貼壁3 d時(shí)光鏡下可見細(xì)胞形態(tài)多呈類圓形，胞體折光性較強(qiáng)。藥物干預(yù)7 d后，對照組中大部分細(xì)胞在7 d時(shí)形態(tài)呈兩極化生長，細(xì)胞突起少，無網(wǎng)狀連接形成。LPA組細(xì)胞突起變細(xì)、萎縮，胞體生長不良，折光性下降。布洛芬組和LPA+布洛芬組較LPA組細(xì)胞突起及分支明顯增多，分支間形成網(wǎng)絡(luò)連接，發(fā)育良好。見圖3。

Fig.3 Comparison of growth and development of cellsbeforeand after treatment(×200)圖3 各組干預(yù)前后細(xì)胞的生長發(fā)育狀況比較（×200）

2.4 藥物干預(yù)后各組OPCs細(xì)胞的免疫熒光染色比較 結(jié)果顯示，布洛芬對細(xì)胞成熟發(fā)育有積極作用，加了LPA后細(xì)胞發(fā)育明顯受到抑制，但當(dāng)LPA和布洛芬同時(shí)添加時(shí)，LPA對細(xì)胞的抑制作用得到了明顯控制，表現(xiàn)為布洛芬組和LPA+布洛芬組細(xì)胞突起明顯多于對照組和LPA組，且對照組細(xì)胞突起明顯多于LPA組，見圖4。布洛芬組和LPA+布洛芬組MBP陽性細(xì)胞數(shù)（OLs）明顯多于對照組和LPA組，而后2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

Fig.4 Comparison of immunofluorescencestainingafter treatment between four groups(×100)圖4 各組干預(yù)后免疫熒光染色比較（×100）

Fig.5 Comparison of thenumber of OLsbetween four groups圖5 各組OLs數(shù)目比較

2.5 MBP表達(dá)的Western blot檢測 結(jié)果顯示，LPA組的MBP相對表達(dá)量明顯低于其他3組，布洛芬組MBP相對表達(dá)量高于LPA＋布洛芬組，見圖6。

3 討論

Fig.6 Comparison of MBPexpression levelsbetween four groupsby Western blot assay圖6 Western blot法比較各組MBP相對表達(dá)量

3.1 中樞性脫髓鞘疾病的研究現(xiàn)狀 中樞性脫髓鞘疾病的高發(fā)病率和年輕化已使其成為影響人類健康的一大因素。尤其在歐美，MS是年輕人中除外傷外導(dǎo)致神經(jīng)障礙最常見的疾病，是增加年輕人死亡率的一大因素［7］。急性中樞性脫髓鞘病變的髓鞘在短期內(nèi)可能再生，然而慢性、復(fù)發(fā)性或者進(jìn)展性髓鞘病變的再生相對比較困難，且極易遺留神經(jīng)功能缺損癥狀。目前針對以MS為代表的自身免疫性脫髓鞘疾病的治療尚無有效的根治藥物，髓鞘再生涉及OLs發(fā)生及成熟過程中多種精細(xì)協(xié)調(diào)機(jī)制，而相關(guān)機(jī)制雖有所進(jìn)展但仍有不足［8］。因此誘導(dǎo)內(nèi)源性髓鞘再生已成為該領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。OLs在神經(jīng)發(fā)生脫髓鞘病變時(shí)，可向病變部位遷移、增殖并替代圍繞神經(jīng)軸突周圍已變性的無功能髓鞘組織［9］。而OLs的再生能力依賴OPCs的增殖分化。因此針對OLs分化發(fā)育成熟機(jī)制的研究有助于臨床良性干預(yù)髓鞘的再生修復(fù)。

3.2 布洛芬對OLs的保護(hù)作用 布洛芬應(yīng)用于臨床已有很多年。近些年來其在經(jīng)典抗炎鎮(zhèn)痛作用外的神經(jīng)保護(hù)研究也越來越多。體外研究證實(shí)布洛芬可在一定程度上減小成熟OLs的凋亡程度［10］，提示布洛芬有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，布洛芬也已被應(yīng)用于阿爾茲海默病的治療［11］。目前已知多種信號通路均參與OLs的分化發(fā)育成熟，如Rho/Rock信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Shh信號通路、BMP信號通路等［12］，其中Rho家族中的鳥苷三磷酸（GTP）酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)中具有重要作用［13-14］。有研究指出布洛芬可通過作用于神經(jīng)系統(tǒng)中的多種細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的RhoA信號通路影響細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化［15］。尤其在OPCs發(fā)育為成熟OLs過程中，Rho信號通路的關(guān)鍵酶RhoA酶的活性狀態(tài)呈逐漸降低的趨勢［16］。有研究提示通過抑制RhoA酶活性可以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞突起生長［17］。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)階段，除了進(jìn)行鹽水對照組的設(shè)置以外，還加入了RhoA激酶激活劑LPA［18］，選擇的LPA濃度為1.0 μmol/L，有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)在該濃度下少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大，突起明顯減少［19］。此外，本實(shí)驗(yàn)中使用的布洛芬濃度為100μmol/L。Roloff等［10］證實(shí)在此濃度下神經(jīng)突即可發(fā)生明顯的伸長。LPA作用于大鼠OLs 2 h后即出現(xiàn)了細(xì)胞突起自末端向胞體方向萎縮，胞間的網(wǎng)狀連接變稀疏的現(xiàn)象，揭示了LPA對于成熟OLs的毒性作用，證實(shí)Rho信號通路保持低活性對于維持成熟OLs完整結(jié)構(gòu)形態(tài)可能具有重要意義［20］。此外，設(shè)計(jì)的4個(gè)組中，在細(xì)胞貼壁3 d后開始進(jìn)行藥物干預(yù)，因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞貼壁基本已經(jīng)完成，開始進(jìn)入形成突起的關(guān)鍵階段［21］，在持續(xù)7 d干預(yù)后，布洛芬組和LPA+布洛芬組中細(xì)胞分化發(fā)育明顯好于對照組和LPA組，且免疫熒光染色和Western blot結(jié)果均顯示布洛芬組中OLs增殖發(fā)育好于LPA+布洛芬組，證明了布洛芬可在一定程度上削弱了LPA對OPCs的毒性作用，且能夠促進(jìn)OPCs向OLs成熟形態(tài)發(fā)育并維持其正常狀態(tài)。

3.3 不足與展望 本實(shí)驗(yàn)在布洛芬對OPCs的生長發(fā)育及OLs的形態(tài)維持方面進(jìn)行了相關(guān)探索，但由于OPCs生長分化發(fā)育受到多種復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外因素的影響［22］，且本實(shí)驗(yàn)思路相對簡單，尚不具備更好的臨床指導(dǎo)作用，在未來的研究中還有待進(jìn)一步探究布洛芬應(yīng)用的最佳時(shí)間窗及最佳劑量，并逐步拓展到其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療研究中，為神經(jīng)保護(hù)和疾病治療提供更多的策略。

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