阿霉素修飾納米銀的制備及其體外抗腫瘤活性研究

楊麗軍，禇麗萍，王婧，任春華，王中強(qiáng)，黃帆

據(jù)美國(guó)抗癌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)顯示，癌癥已成為人類最為致命的疾?。?］，而癌癥治療一直以來(lái)都是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米藥物引起了研究者越來(lái)越多的關(guān)注。通過(guò)物理包裹或化學(xué)鍵合的方式將傳統(tǒng)化療藥［阿霉素（DOX）、紫杉醇、喜樹(shù)堿等］［2］負(fù)載到納米粒上，即可方便地制得納米抗癌藥，不僅提高了疏水性化療藥在體內(nèi)的溶解度和穩(wěn)定性［3］，而且能利用納米材料獨(dú)有的血液長(zhǎng)循環(huán)能力和增強(qiáng)滲透滯留（EPR）效應(yīng)在腫瘤組織高效富集［4］，從而提高了化療藥的生物利用度，同時(shí)降低了其對(duì)正常組織的毒副作用。最近，研究者發(fā)現(xiàn)廣譜抗菌劑納米銀（Ag NPs）具有良好的抗腫瘤效果［5-6］。盡管其抗腫瘤機(jī)制尚不明確，但一般認(rèn)為Ag NPs能夠很容易地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而不可逆地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死［7］。基于DOX和Ag NPs的抗腫瘤活性，Badiger課題組［8］及Mamdouh課題組［9］均通過(guò)靜電吸附作用將DOX負(fù)載到Ag NPs表面，制備出聯(lián)合抗腫瘤藥物。然而，該藥物存在生理穩(wěn)定性較差及難以在腫瘤組織特異性釋放DOX的缺點(diǎn)，大大限制了其應(yīng)用前景。鑒于硫辛酰肼（LA-NHNH2）的酰肼基團(tuán)能夠與DOX的羰基形成具有酸敏感的腙鍵，且其硫原子（S）能夠與銀（Ag）形成穩(wěn)定的Ag-S鍵，因此，本實(shí)驗(yàn)擬在LA-NHNH2的兩端分別以化學(xué)鍵連接Ag NPs和DOX，制備一種生理穩(wěn)定性好且具有pH響應(yīng)性的阿霉素-納米銀（DOX-Ag NPs）聯(lián)合抗腫瘤藥物，通過(guò)噻唑藍(lán)比色法比較該納米抗癌藥與單一的Ag NPs及DOX的抗腫瘤活性，從而為臨床腫瘤治療提供新的研究思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DOX·HCl、硝酸銀（AgNO3）、檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）、硼氫化鈉（NaBH4）、硫辛酸（LA）、N，N’-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）購(gòu)自于百靈威科技有限公司；巰基聚乙二醇（PEG-SH，相對(duì)分子質(zhì)量為2 000）購(gòu)自于上海炎怡生物科技有限公司；水合肼（NH2NH2·H2O）、無(wú)水甲醇（MeOH）、無(wú)水乙醇（EtOH）、三氟乙酸（TFA）等其他化學(xué)試劑均購(gòu)自于天津江天化工技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司；人肝癌HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自有。

1.1.2 儀器 超純水儀（Merck Instrument，德國(guó)）；300 MHz核磁共振波譜儀（Bruker Instrument，德國(guó)）；液質(zhì)聯(lián)用儀（AB Sciex Instrument，美國(guó)）；動(dòng)態(tài)光散射粒度儀（Malvern Instrument，英國(guó)）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Shimadzu Instrument，日本）；熒光分光光度計(jì)（Shimadzu Instrument，日本）；電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（PerkinElmer Instrument，美國(guó)）；透射電子顯微鏡（TEM，F(xiàn)EIInstrument，美國(guó)）；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo Scientific Instrument，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 硫辛酰肼-阿霉素（LA-NHN=DOX）的合成及表征 LA-NHN=DOX的合成路線見(jiàn)圖1［10］。首先，稱取LA（3.09 g，15 mmol）、EtOH（10.4 g，225 mmol）及 DMAP（0.92 g，7.5 mmol）溶于120 mL二氯甲烷（CH2Cl2）中，0℃下滴加含DCC（4.63 g，23 mmol）的CH2Cl2（30 mL）溶液，0℃下攪拌反應(yīng)1 h后室溫下繼續(xù)反應(yīng)24 h，過(guò)濾除去反應(yīng)沉淀，濾液經(jīng)過(guò)旋蒸脫除溶劑以及硅膠柱層析純化（淋洗液為體積比15∶1的石油醚和乙酸乙酯）得到黃色油狀產(chǎn)物硫辛酸乙酯（LACOOEt），產(chǎn)率為81%。然后，將LACOOEt（2.96 g，12.7 mmol）溶于 MeOH（50 mL）中，加入 NH2NH2·H2O（4.3 mL），40℃下攪拌反應(yīng)過(guò)夜，加入水淬滅反應(yīng)并用乙酸乙酯萃取3次，收集的有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液洗滌2次，經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥、旋蒸脫除溶劑以及硅膠柱層析純化（淋洗液為體積比15∶1的CH2Cl2和MeOH為淋洗液）得到黃色固體產(chǎn)物L(fēng)ANHNH2，產(chǎn) 率 為 83%。 最 后 ，將 LA-NHNH2（132 mg，0.6 mmol）和DOX·HCl（116 mg，0.2 mmol）溶于MeOH（30 mL）中，加入TFA（50μL），室溫下避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)液濃縮至1 mL并逐滴加入到乙腈（25 mL）中，得到的懸浮液在4℃冰箱中靜置過(guò)夜，離心獲得的紅色固體用乙腈多次洗滌便可得到最終的目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)A-NHN=DOX，產(chǎn)率為72%。通過(guò)核磁氫譜（1H NMR）和高分辨質(zhì)譜（HRMS）對(duì)終產(chǎn)物L(fēng)A-NHN=DOX進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)確證。

Fig.1 Thesynthetic routeof LA-NHN=DOX［10］圖1 LA-NHN=DOX的合成路線［10］

1.2.2 Ag NPs的制備及表征 首先，以超純水為溶劑，分別配置AgNO3溶液（0.25 mmol/L）、Na3C6H5O7·2H2O溶液（0.31 mmol/L）及NaBH4溶液（0.25 mmol/L），4℃下避光靜置1 h。然后，將AgNO3溶液（100 mL）和Na3C6H5O7溶液（100 mL）加入到500 mL圓底燒瓶中，劇烈攪拌下快速加入NaBH4溶液（6 mL），室溫下攪拌反應(yīng)10 min后加熱至沸騰，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1.5 h，隨后冷卻至4℃，避光靜置過(guò)夜便可得到以Na3C6H5O7為穩(wěn)定劑的Ag NPs溶液。最后，劇烈攪拌下向上述Ag NPs溶液中滴加4 mL PEG2000-SH（2.8 mg，1.4 μmol）水溶液，室溫下反應(yīng)12 h，采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋對(duì)上述混合溶液進(jìn)行透析，除去游離化合物，便可制得最終以PEG為穩(wěn)定劑的Ag NPs溶液［11-12］。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和TEM分析Ag NPs的粒徑和形貌；通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測(cè)定Ag NPs溶液中的Ag含量；通過(guò)電位儀測(cè)定Ag NPs的ζ-電位；通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜表征Ag NPs的光學(xué)性質(zhì)。

1.2.3 DOX-Ag NPs的制備及表征 劇烈攪拌下向Ag NPs溶液（10 mL）中滴加2 mL LA-NHN=DOX（746 μg，1 μmol）MeOH溶液，室溫下反應(yīng)12 h，采用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋對(duì)上述混合溶液進(jìn)行透析，除去游離的LANHN=DOX分子，便可得到DOX-Ag NPs溶液。通過(guò)DLS和TEM分析DOX-Ag NPs的粒徑和形貌；通過(guò)ICP-MS測(cè)定DOX-Ag NPs溶液中的Ag含量；通過(guò)電位儀測(cè)定DOX-Ag NPs的ζ-電位；通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜表征DOX-Ag NPs的光學(xué)性質(zhì)。

1.2.4 體外藥物釋放實(shí)驗(yàn) 取6份DOX-Ag NPs溶液（3 mL）裝入截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋中，將其中3份分別置于裝有50 mLPBS（pH 7.4）的燒杯中，另外3份分別置于裝有50 mL PBS（pH 5.5）的燒杯中，37℃恒溫震蕩，于不同時(shí)間點(diǎn)取出定量釋放液，同時(shí)向燒杯中補(bǔ)充等體積的相應(yīng)PBS緩沖液。利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定釋放液中游離DOX的熒光強(qiáng)度，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線（DOX熒光強(qiáng)度-DOX濃度），檢測(cè)不同時(shí)間DOX的釋放量并繪制釋放曲線。

1.2.5 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 取人肝癌HepG2細(xì)胞，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔5×103個(gè)接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，向孔內(nèi)分別加入一系列濃度梯度（按照DOX的濃度為0、0.1、0.5、1、2、5、10、20 mg/L）的DOX、Ag NPs（Ag NPs量取決于加入的DOX-Ag NPs量，兩者的Ag濃度保持一致）和DOX-Ag NPs，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，每孔加入20μL MTT溶液（5 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液后每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），充分震蕩后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm下各孔的吸光度（A）值。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，根據(jù)公式計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞生存率并繪制生存率曲線。細(xì)胞生存率=實(shí)驗(yàn)組A平均值/對(duì)照組A平均值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LA-NHN=DOX的合成及結(jié)構(gòu)表征 LANHN=DOX的1H NMR譜見(jiàn)圖2，具體數(shù)據(jù)為：1H NMR（300 MHz，DMSO）δ14.11（d，J=1.6 Hz，1H），13.32（s，1H），10.33（s，1H），8.02～7.93（m，3H），7.91～7.87（m，2H），7.67～7.61（m，1H），5.82（t，J=4.6 Hz，1H），5.57（s，1H），5.49（d，J=5.7 Hz，1H），5.33～5.27（m，1H），4.97～4.88（m，1H），4.46～4.33（m，2H），4.08～4.00（m，1H），3.96（s，3H），3.61～3.57（m，1H），3.29（d，J=18.1 Hz，1H），3.12～3.02（m，2H），2.73（d，J=17.3 Hz，1H），2.30～2.21（m，2H），2.19～2.07（m，2H），1.95～1.80（m，2H），1.76～1.66（m，2H），1.57～1.50（m，1H），1.45～1.39（m，1H），1.37～1.26（m，3H），1.21～1.09（m，5H）；通過(guò)HRMS在746.275 6處檢測(cè)到分子離子峰，與［LA-NHN=DOX+H+］理論相對(duì)分子質(zhì)量746.241 2相一致；1H NMR和HRMS均證明了LA-NHN=DOX的成功合成。

Fig.2 1H NMRspectraof compound LA-NHN=DOX圖2 化合物L(fēng)A-NHN=DOX的核磁共振氫譜

2.2 Ag NPs及DOX-Ag NPs的表征 通過(guò)DLS表征Ag NPs的粒徑為（32.3±2.5）nm，分布指數(shù)（PDI）為0.29，DOX-Ag NPs的粒徑為（40.4±3.8）nm，PDI為0.54，DOX-Ag NPs的粒徑較Ag NPs增大（t=3.084，n=3，P＜0.05），見(jiàn)圖3。TEM鏡下可見(jiàn)兩種納米粒均為球形結(jié)構(gòu)，且分布均勻無(wú)聚集現(xiàn)象，測(cè)得的Ag NPs的粒徑為（19.3±2.1）nm，DOX-Ag NPs的粒徑為（20.1±1.8）nm，見(jiàn)圖4。Ag NPs及DOX-Ag NPs的表面電荷分布存在明顯不同，通過(guò)電位儀測(cè)得兩者的ζ-電位分別為（-1.2±0.7）mV和（15.8±0.9）mV。從紫外-可見(jiàn)吸收光譜可知，Ag NPs的最大吸收波長(zhǎng)為403 nm，而DOX-Ag NPs的最大吸收波長(zhǎng)稍有紅移，為416 nm，且在480 nm處DOX-Ag NPs的吸光度（0.254）明顯大于Ag NPs的吸光度（0.151），見(jiàn)圖5。兩者的熒光發(fā)射光譜見(jiàn)圖6，在484 nm波長(zhǎng)激發(fā)下，游離DOX分子在590 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰，而DOX-Ag NPs上的DOX熒光強(qiáng)度明顯降低（由9 888降為1 633）。此外，通過(guò)ICP-MS測(cè)得Ag NPs和DOX-Ag NPs的銀濃度分別為18 mg/L和13 mg/L。

2.3 體外藥物釋放實(shí)驗(yàn) 通過(guò)透析法結(jié)合熒光光譜檢測(cè)DOX-Ag NPs在不同pH下的DOX累積釋放率，結(jié)果見(jiàn)圖7。37℃下，在不同pH的PBS中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DOX的累積釋放率均不斷升高，但pH5.5下DOX的釋放速度明顯快于pH 7.4下DOX的釋放速度。48 h后，pH 7.4下DOX累積釋放率為（33.0±3.0）%，而在pH 5.5下DOX累積釋放率可達(dá)（65.0±2.8）%。

Fig.3 Hydrodynamic sizedistributionsof Ag NPs and DOX-Ag NPs圖3 Ag NPs及DOX-Ag NPs的粒徑分布

Fig.4 TEM imagesof Ag NPs(A)and DOX-Ag NPs(B)圖4 Ag NPs（A）及DOX-Ag NPs（B）的TEM照片

Fig.5 UV-vis absorption spectraof Ag NPsand DOX-Ag NPs圖5 Ag NPs及DOX-Ag NPs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

Fig.6 Fluorescencespectraof DOX and DOX-Ag NPs圖6 DOX及DOX-Ag NPs的熒光光譜

Fig.7 DOX releaseprofiles of DOX-Ag NPsat pH 7.4 or pH 5.5圖7 DOX-Ag NPs中DOX在pH 7.4及pH 5.5下的釋放曲線

2.4 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn) DOX、Ag NPs和DOX-Ag NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制均呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，DOX及Ag的濃度越高，細(xì)胞生存率越低。當(dāng)DOX濃度為0 mg/L時(shí)，3組間細(xì)胞生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)DOX濃度為0.1 mg/L（Ag濃度為0.09 mg/L）時(shí)，Ag NPs組細(xì)胞生存率高于DOX組，DOXAg NPs組細(xì)胞生存率低于Ag NPs組（P＜0.05），與DOX組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在其他濃度下，Ag NPs組細(xì)胞生存率均高于DOX組，DOX-Ag NPs組均低于DOX組和Ag NPs組（均P＜0.05）。見(jiàn)圖8。

Fig.8 Comparison of theeffects of DOX,Ag NPs and DOX-Ag NPson survival ratesof HepG2 cells圖8 DOX、Ag NPs和DOX-Ag NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的生存率影響比較

3 討論

與單一療法相比，多種藥物的聯(lián)合治療是一種更為有效的癌癥治療方法，原因是聯(lián)合治療過(guò)程中，各種藥物不僅能發(fā)揮協(xié)同治療效果，而且藥物用量低，毒副作用?。?3］。之前基于DOX和Ag NPs聯(lián)合抗腫瘤的研究中，均是通過(guò)靜電吸附作用將DOX負(fù)載到Ag NPs表面。然而，由于靜電作用力較弱，導(dǎo)致DOX-Ag NPs生理穩(wěn)定性較差，DOX易泄漏。此外，上述DOX-Ag NPs不具有腫瘤pH環(huán)境響應(yīng)性，不能在腫瘤組織特異性釋放藥物，降低了治療效果的同時(shí)也增加了對(duì)正常組織的毒副作用，大大限制了其應(yīng)用前景。本研究所制備的具有pH響應(yīng)性的DOX-Ag NPs聯(lián)合抗腫瘤納米藥物不僅保持了納米藥物體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)和通過(guò)EPR效應(yīng)靶向腫瘤的能力，而且由于DOX是通過(guò)化學(xué)鍵連的方式負(fù)載，DOXAg NPs的生理穩(wěn)定性得到提升。此外，DOX-Ag NPs的pH響應(yīng)特性使DOX能夠特異性地在腫瘤組織中釋放，減少了藥物在體循環(huán)過(guò)程中的泄漏，降低了對(duì)正常組織的毒副作用［14］。

本研究中LA-NHN=DOX的1H NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道一致，且通過(guò)HRMS檢測(cè)到746.275 6處的分子離子峰與［LA-NHN=DOX+H+］理論相對(duì)分子質(zhì)量746.241 2相一致，證明了LA-NHN=DOX的成功合成。通過(guò)材料表征可以發(fā)現(xiàn)，DOX-Ag NPs的粒徑較Ag NPs增大，說(shuō)明DOX成功負(fù)載到Ag NPs上。值得注意的是，由DLS測(cè)得的粒徑大于由TEM測(cè)得的粒徑，原因是納米粒在水中處于溶脹狀態(tài)，DLS測(cè)得的是其水合粒徑，而TEM測(cè)試采用的是干燥樣品，制樣過(guò)程中納米粒收縮，導(dǎo)致測(cè)得的粒徑偏小。負(fù)載上DOX之后，納米銀的ζ-電位由（-1.2±0.7）mV增大到（15.8±0.9）mV，原因是DOX分子上的氨基帶正電荷，DOX的成功負(fù)載增加了納米銀表面的正電荷數(shù)目。DOX-Ag NPs的紫外-可見(jiàn)吸收峰為416 nm，且在480 nm處的吸光度較Ag NPs大，分別與典型的納米銀最大吸收波長(zhǎng)［15］和DOX最大吸收波長(zhǎng)［16］相符合，進(jìn)一步證明DOX已成功負(fù)載到Ag NPs上。DOX-Ag NPs上的DOX熒光強(qiáng)度明顯低于游離DOX的熒光強(qiáng)度，原因是DOX與Ag NPs之間存在強(qiáng)烈的共振能量轉(zhuǎn)移［17］，導(dǎo)致DOX熒光被淬滅。

基于腫瘤組織弱酸性的特點(diǎn)，用pH 5.5的PBS模擬腫瘤微環(huán)境，pH 7.4的PBS模擬正常生理?xiàng)l件。藥物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DOX-Ag NPs在弱酸性環(huán)境中能夠快速釋放出DOX，這主要是因?yàn)長(zhǎng)ANHN=DOX分子中的腙鍵具有酸敏感性［18］，能夠在酸性條件下發(fā)生斷裂，從而加速了DOX的釋放。該納米抗癌藥在正常生理環(huán)境中DOX釋放緩慢，有利于延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間，增加在腫瘤部位的富集；而一旦到達(dá)腫瘤組織，便能夠在腫瘤弱酸性環(huán)境中快速釋放出DOX，發(fā)揮抗腫瘤活性。利用體循環(huán)與腫瘤微環(huán)境之間存在的pH梯度，便可實(shí)現(xiàn)抗癌藥物DOX的可控性釋放。

體外抗腫瘤結(jié)果顯示，DOX-Ag NPs具有較游離DOX及Ag NPs更好的腫瘤細(xì)胞增殖抑制效果，這主要是由于DOX-Ag NPs既能發(fā)揮DOX破壞細(xì)胞DNA的功能，還能通過(guò)Ag NPs促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合殺傷。此外，游離DOX受到水溶性影響，殺傷作用受到限制，降低了其抗腫瘤效果。

本課題制備的DOX-Ag NPs是一種有效的聯(lián)合抗腫瘤納米制劑，能夠?qū)OX和Ag NPs穩(wěn)定結(jié)合，并通過(guò)其酸敏感的特性在腫瘤部位智能釋放藥物，為基于納米銀的抗癌藥物的合理設(shè)計(jì)提供了有益的借鑒，值得進(jìn)行深入探究。

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