基于mRNA和miRNA表達譜及基因甲基化譜的直腸腺癌發(fā)生相關分子標志物的研究

秦海，華揚，石洋，李鵬

直腸腺癌（rectal adenocarcinoma，READ）是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約120萬，死亡人數(shù)約占所有惡性腫瘤的8%［1-2］。目前認為結直腸癌變是一個多基因參與的極為復雜的過程，隨著二代測序技術的發(fā)展，諸多臨床及實驗研究對其發(fā)病機制進行了探討，但仍未明確。在早期READ（Ⅰ～Ⅱ期）中，LINE-1低甲基化的患者生存期短、腫瘤復發(fā)率高［3］。KRAS突變和CDKN2A啟動子甲基化與直腸癌的總生存期（overall survival，OS）相關［4］。miR-573、miR-579和miR-802的異常表達影響患者的OS［5］。術前進行放化療的READ患者中，XRCC3過表達的患者化療效果更好［6］。一些潛在靶基因與患者生存期和療效顯著相關。本文基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，綜合分析READ相關miRNA、mRNA和DNA甲基化數(shù)據(jù)，以期進一步闡明READ的發(fā)病機制并找出潛在早期生物標志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 從TCGA（https://cancergenome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載獲得mRNA、miRNA表達數(shù)據(jù)及DNA甲基化數(shù)據(jù)和相應的READ患者的臨床資料。共包含155例READ患者的組織標本，無其他惡性腫瘤發(fā)病史、未接受輔助治療，其中TNM分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和未知的患者分別為29、49、48、23、6例。mRNA表達數(shù)據(jù)、miRNA表達數(shù)據(jù)及甲基化數(shù)據(jù)的測序平臺分別為UNC_IlluminaHiseq_RNASeqV2、BCGSC_Illu?minaHiSeq_miRNASeq和JHU_USC_Human Methylation450。

1.2 鑒定差異表達的 mRNAs（DEmRNAs）和 miRNAs（DEmiRNAs） 利用DESeq2軟件包鑒定直腸腺癌中DEmRNAs和 DEmiRNAs［8］。 閾值為FDR ＜ 0.000 1且|log2fold change|＞ 2。

1.3 差異甲基化的CpG位點分析 利用R語言中的COHCAP軟件包和t檢驗鑒定READ相對于正常對照標本之間差異甲基化的CpG位點（differentially methylated sites，DMSs）［9］，閾值為校正P＜ 0.05并且|△β|＞0.2。同時對DMSs的相應基因和CpG島進行GO注釋。

1.4 曼哈頓圖分析和熱圖分析 利用R語言中的“qqman”包，繪制差異甲基化CpG位點在22條染色體中的分布圖，即曼哈頓圖。利用R語言中的“pheatmap”包，繪制正常對照和READ中差異甲基化的CpG位點的雙向聚類圖。

1.5 DEmiRNAs靶基因預測 利用miRWalk數(shù)據(jù)庫中的RNA22、miRanda、miRDB、PICTAR2 和 Targetscan 預 測DEmiRNAs的靶基因，將至少4個軟件同時預測到的靶基因記作DEmiRNAs的潛在靶基因［10］。

1.6 DEmiRNA-DEmRNA網(wǎng)絡的可視化 通過PCC分析和miRWalk數(shù)據(jù)庫鑒定出具有負相關性的DEmiRNADEmRNA關系對，并利用Cytoscape軟件（http://cytoscape.org）將其可視化［11］。

1.7 DEmRNAs與DNA甲基化的相關性分析 鑒定發(fā)生了差異表達及差異甲基化的基因，并分析基因表達與DNA甲基化之間的相關性。

1.8 KEGG途徑富集分析 利用KOBAS2.0在線軟件進行KEGG通路富集分析，探索異常甲基化且異常表達的基因富集的信號通路。以P＜0.05作為篩選的閾值。

1.9 qRT-PCR驗證 從天津市人民醫(yī)院結直腸外科獲得5例READ患者的腫瘤組織和癌旁組織。本研究由天津市聯(lián)合醫(yī)學中心倫理委員會批準，符合“赫爾辛基宣言”，所有參與到該研究的患者均簽署了知情同意書。使用TRIzol試劑（Invitrogen，CA，USA）提取腫瘤和癌旁組織的總RNA。使用Super-ScriptⅢ反轉錄試劑盒（Invitrogen，CA，USA）反轉錄成cDNA。內參基因GAPDH、目的基因引物序列見表1。使用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）在 Biosystems 7500（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）上進行qRT-PCR反應。PCR擴增程序為：預變性95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃30 s，循環(huán)40次。反應結束后，利用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

Tab.1 Theprimersfor qRT-PCR表1 qRT-PCR所用到的引物

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DEmRNAs的鑒定 數(shù)據(jù)中共篩選出1 192個DEmRNAs，其中上調439個，下調753個。上調最顯著的3個mRNA分別是KRT23、FOXQ1和DPEP1；下調最顯著的3個mRNA分別是DPP6、PLP1和SCN7A，表2列舉了表達差異最顯著的前10個表達上調的及表達下調的基因。

2.2 DEmiRNAs的鑒定 數(shù)據(jù)中共篩選出27個DEmiRNAs，其中17個上調，10個下調。上調最明顯的3個miRNAs分別為hsa-mir-424、hsa-mir-215和hsa-mir-374a，下調最明顯的3個miRNAs分別為hsamir-328、hsa-mir-129-1和hsa-mir-129-2，見表3。

2.3 鑒定異常甲基化的CpG位點 數(shù)據(jù)中共鑒定出6 403個異常甲基化的CpG位點，包括4 275個高甲基化位點和2 128個低甲基化位點，分別位于446個基因上。異常甲基化的CpG位點在22條染色體中的分布情況見圖1，異常甲基化CpG位點在22條染色體上均有分布，且在2～15號染色體上分布較多。通過雙向聚類分析前100個高甲基化和前100個低甲基化的位點，見圖2。

Tab.2 Thetop 10 different expression mRNAsin the READ表2 READ中表達差異最顯著的10個mRNAs

Tab.3 The top 10 different expression miRNAsin the READ表3 READ中表達差異最顯著的10個miRNAs

2.4 鑒定DEmiRNA-DEmRNA關系對 數(shù)據(jù)中共鑒定出27個DEmiRNA的668個靶基因。通過可視化DEmiRNA-DEmRNA網(wǎng)絡構建結果顯示，DEmiRNA與DEmRNA之間共存在1 987個DEmiRNA-DEmRNA關系對，其中7個DEmRNA與DEmiRNA相互作用較強。如圖3所示，LONRF2受hsa-mir-335、hsa-mir-20a和hsa-mir-452負調節(jié)；has-mir-182負調節(jié) PDZRN4、GNAO1和 CNGA3；hsa-mir-19b-2負調節(jié)GNAO1、RSPO2和CNGA3。

2.5 鑒定DNA甲基化-DEmRNA 分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)555個高甲基化的CpG島定位于441個基因，6個低甲基化的CpG島定位于5個基因。將此446個基因與668個DEmRNAs進行重合分析，其中的50個基因既發(fā)生了差異甲基化也發(fā)生差異表達。這50個基因中，11個表達上調，39個表達下調，且均為高甲基化，見圖4。

2.6 功能注釋 對上述50個基因進行富集分析的結果表明，這些基因富集于9個信號通路，其中6個通路中均出現(xiàn)GRIA4和GNAO1，5個通路中出現(xiàn)GRIN2D，見表4。

2.7 qRT-PCR驗證 為進一步驗證生物信息學分析結果，隨機篩選9個基因進行qRT-PCR檢測，驗證結果顯示，在READ中，ATP2B4、NR3C1、ROR1、PRKCB 的表達水平下調，TCF7、SLC6A6、PDPN、WNT2和ONECUT2的表達水平上調，與生物信息學分析結果一致，見表5。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在READ腫瘤組織標本SORCS1、PDZRN4、LONRF2、CNGA3、HAND2、RSPO2 和GNAO1低表達，且這7個基因的CpG島高甲基化、對應的miRNAs高表達，值得進一步研究。RSPO2是Wnt/β-catenin信號通路的調節(jié)因子。在乳頭狀甲狀腺癌、胰腺癌和肺腺癌中，RSPO2均出現(xiàn)表達降低［12-14］。本研究RSPO2明顯下調，應屬于抑癌基因，但也有研究報道RSPO2過表達可抑制結直腸癌細胞的增殖［15］。GNAO1基因是Gα蛋白亞家族的成員之一。本研究中，GNAO1呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，表達水平下調。在肝癌中，GNAO1下調會促進肝癌細胞的增殖并抑制其衰老［16］。同時在胃癌中GNAO1沉默會促進胃癌細胞的增殖，抑制其凋亡［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，PDZRN4在READ中高甲基化且表達下調，與其在肝癌中的研究結果一致［18］。本研究中，HAND2表達下調并伴隨著甲基化水平升高。HAND2在子宮內膜樣癌幾乎不表達，在敲除HAND2小鼠模型中能夠導致癌細胞持續(xù)地增殖［19］，然而也有研究發(fā)現(xiàn)，HAND2在早期肺鱗癌和成神經(jīng)細胞瘤中高表達［20-21］。SORCS1和CNGA3在READ中高甲基化且表達下調。LONRF2是明顯下調的DEmRNAs之一，本研究顯示LONRF2與READ相關。

Fig.4 The comparisonsbetween the DEmRNA,the DEmiRNA targeted by the DEmRNAand the aberrant methylation genes圖4 DEmRNAs，DEmiRNAs和差異甲基化DNA的關系

Tab.4 The enriched pathways from the 50 aberrant methylation genes表4 含有50個異常甲基化基因的信號通路

Tab.5 The expression levels of DEmRNAs in the 5 tumor samples and 5 adjacent normal samples of the READ表5 通過qRT-PCR驗證5個READ腫瘤組織和癌旁組織中DEmRNAs的表達水平 （n=5，±s）

Tab.5 The expression levels of DEmRNAs in the 5 tumor samples and 5 adjacent normal samples of the READ表5 通過qRT-PCR驗證5個READ腫瘤組織和癌旁組織中DEmRNAs的表達水平 （n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別癌旁組織腫瘤組織t ATP2B4 0.990±0.001 0.474±0.004 6.203＊＊NR3C1 1.004±0.001 0.630±0.001 9.850＊＊ROR1 1.042±0.003 0.421±0.000 5.456＊＊PRKCB 0.996±0.000 0.452±0.000 5.903＊＊TCF7 0.984±0.003 22.733±0.493 2.439＊SLC6A6 1.025±0.004 36.833±2.583 4.360＊PDPN 1.009±0.001 7.496±0.001 6.930＊＊WNT2 1.026±0.004 9.840±0.013 5.743＊＊ONECUT2 1.007±0.001 5.616±0.014 3.211＊

本文基于TCGA數(shù)據(jù)庫，鑒定了READ腫瘤組織標本中DEmiRNAs、DEmRNAs和差異甲基化的DNA。RSPO2、GNAO1、PDZRN4、HAND2、SORCS1、CNGA3和LONRF2可能在READ的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用，本研究為READ發(fā)生機制的闡明和早期診斷提供了理論依據(jù)。

（圖1～3見插頁）

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