紅掌組織培養(yǎng)過程中的外植體褐變研究

鄭萍 康麗云 黃才華 郁琳潔

摘要：在培養(yǎng)紅掌組織的過程中，外植體容易產生褐變現(xiàn)象，從而對紅掌組織的正常培養(yǎng)過程造成嚴重影響。在本文中選取紅掌“紅粉佳人”作為選材產品，其外植體選取健康植株幼嫩葉片，探究與分析在培養(yǎng)愈傷組織過程中出現(xiàn)褐變的現(xiàn)象。采用不相同的抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸等吸附劑、抗氧化劑、培養(yǎng)基硬度的防褐變現(xiàn)象進行觀察與研究。經研究發(fā)現(xiàn)，將0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP、4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L均添加到5g/L硬度的瓊脂MS培養(yǎng)基中，可在最大限度上對褐變現(xiàn)象進行有效控制，且提升愈傷誘導率。

關鍵詞：外植體；褐變現(xiàn)象；紅掌組織

中圖分類號： S682.14 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.10.030

紅掌又可稱作火鶴花、紅鵝掌、紅掌植物界、安祖花，是天南星科多年生常綠草本植物[1]。紅掌的莖葉從基部萌出，呈綠色，全緣，卵心形或者是長圓狀心形，莖節(jié)較短。哥倫比亞、哥斯達黎加、厄瓜多爾等熱帶雨林地區(qū)盛產紅掌，主要是因其適應潮濕溫暖、不喜光的外部環(huán)境條件，也可附生在巖石上、樹上或者是地上。紅掌具有較長花期，可常年開花，且放置于水瓶中生長期可長達30天左右，是一種具有極高觀賞價值的高檔盆栽[2]。在通常情況下，紅掌在繁殖過程中主要是以分株為主，必要時可采用扦插作為輔助繁殖，其繁殖速度相對較慢。為了更好地滿足與適應市場需求，其繁殖途徑主要是以組織培養(yǎng)為主。但在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)外植體褐變現(xiàn)象，鑒于此，在本次研究中，探索出防褐變的最佳條件，旨在全面增長繁殖系數(shù)以及誘導率。

1資料與方法

1.1一般資料

選取紅掌“紅粉佳人”作為選材產品，其外植體選取健康植株幼嫩葉片，探究與分析在培養(yǎng)愈傷組織過程中出現(xiàn)褐變的現(xiàn)象。采用不相同的抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸等吸附劑、抗氧化劑、培養(yǎng)基硬度的防褐變現(xiàn)象進行觀察與研究。

1.2試驗方法

選取紅掌“紅粉佳人”作為選材產品，其外植體選取健康植株幼嫩葉片。采用自來水將試材進行反復沖洗，放置在無菌室超凈工作臺上，給予75%酒精進行預處理，處理時間控制在30秒。隨即在處理過程中再給予0.1%升汞，處理時間控制在8分鐘。使用無菌水再次進行反復沖洗，6次即可，輕微震蕩直到完全清除升汞。采用無菌濾紙將剩余水分吸干之后，把其葉片切成小方塊4～6mm，在不同硬度培養(yǎng)基中進行接種操作。外植體5個/瓶，10瓶/培養(yǎng)基，重復3次[3]。在選取培養(yǎng)基過程中，使用4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS，將30g/L蔗糖加入到其中。除了將濃度不相同的瓊脂添加到不同硬度培養(yǎng)基之外，還需將5g/L瓊脂添加到121℃的其他試驗處理培養(yǎng)基中，進行滅菌操作25min。設定（25±2）℃為最佳培養(yǎng)溫度，其每天的陽光照射時長應在13h，光照強度約為1300lx，轉瓶時間為每個月1次。待接種2個月后，觀察并同步記錄褐變情況、愈傷誘導率以及褐變率。基本培養(yǎng)基以4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS培養(yǎng)基為主，將不相同的抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸等吸附劑、抗氧化劑添加到基本培養(yǎng)基中，并對試驗處理進行設計，對照組則為未添加抗氧化劑與吸附劑進行試驗處理。通過上述方法可分析出，不同添加物處理對愈傷誘導、外植體褐變現(xiàn)象的影響。同樣，在分析不同硬度培養(yǎng)基試驗處理對愈傷誘導、外植體褐變現(xiàn)象的影響過程中，基本培養(yǎng)基以4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS培養(yǎng)基為主，將濃度不相同的瓊脂添加到基本培養(yǎng)基中，對不同硬度試驗處理進行設計。此外，將0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP添加到每個處理培養(yǎng)基中。

1.3統(tǒng)計學方法

在SPSS21.0統(tǒng)計軟件中算出本次研究所有數(shù)據(jù)，（X2）（%）分別表示計數(shù)資料，（t）（x±s）分別表示計量資料，（P<0.05）則表示為差異明顯，存在統(tǒng)計學意義。

2結果和分析

2.1 不同添加物處理對愈傷誘導、褐變現(xiàn)象的影響

待接種2個月后，將抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸添加到培養(yǎng)基中能夠發(fā)揮出抗褐變的效果。其中，葉酸褐變率最高，活性炭AC褐變率最少。經分析，主要是由于活性炭的吸附能力較強，能夠將帶有褐色的有毒物質進行吸附，從而在一定程度上避免因有害物質對外植體產生嚴重影響，使褐變率降低。雖然活性炭的褐變率較低，但會將培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑進行吸附，大幅降低了愈傷誘導率，對形成紅掌愈傷組織具有阻礙作用。因此，在形成紅掌愈傷組織的過程中，活性炭AC不是最佳防褐變劑。而通過添加聚乙烯吡咯烷酮，其褐變率為24%，僅次于活性炭，而愈傷誘導率高達76%，高于抗壞血酸VC、檸檬酸、葉酸?？傊?，在上述5個添加物中，聚乙烯吡咯烷酮具有良好的處理成效，是最佳防褐變劑（詳見表1）。

2.2 不同硬度培養(yǎng)基對外植體褐變現(xiàn)象的影響

瓊脂濃度越高，則培養(yǎng)基硬度越大。硬度為4的培養(yǎng)基，瓊脂濃度為5 g·L-1，其愈傷誘導率最高，而褐變率可達到最低值。隨著培養(yǎng)基硬度的不斷增加，其褐變率也隨之不斷提高。經深入分析，認為可能是由于在外植體傷口附近聚集了過多的褐色有害物質而無法得到擴散，從而導致局部有害物質不斷累積，最終使褐變程度不斷上升（詳見表2）。

3討論

外植體褐變指的是在培養(yǎng)組織的過程中，在培養(yǎng)基中外植體釋放出褐色物質，從而導致培養(yǎng)基也隨之變成褐色，其培養(yǎng)材料逐漸死亡[4-6]。褐變的發(fā)生機制主要是因外植體中的多酚氧化酶以及酚類化合物被逐漸氧化之后所產生一種帶有褐色的醌類化合物，并受到酪氨酸酶的影響，與蛋白質進行結合，從而致使其他酶系統(tǒng)失去活性，引起組織代謝紊亂，最終死亡[7]。在正常組織中，酶沒有受到活化作用的影響，或者是定位分隔酚與酶，從而降低了褐變率，這樣一來，外植體材料在不同培養(yǎng)環(huán)境下均能對多酚氧化酶以及酚類化合物產生不同程度的影響。單寧含量、木本植物或者是含有高色素的植物均能產生褐變現(xiàn)象，這主要是因為單寧、木質素、色素是酚類糖苷化合物的合成前體[8]。此外，還應重視季節(jié)因素。有相關學者曾在研究報道中指出，在1月份時，歐洲栗所形成的酚類相對較少，而到了6月份左右，顯著增加了酚類含量，從而提高了褐變率[9-11]。還有研究證實，外植體組織的不同受傷程度會對褐變造成直接影響。在外植體的切取過程中，應注意避免因增加其傷口面積而提高褐變現(xiàn)象。有研究者提出，選取葉片容易增加外植體褐變，該研究者在培養(yǎng)油棕組織的過程中選取葉片，由于組織出現(xiàn)高度分化從而引起褐變現(xiàn)象，但選取胚培養(yǎng)方式，其褐變率較低[12-13]。因此，在選取葉片中如何有效避免出現(xiàn)褐變現(xiàn)象已成為目前研究者所需面臨的重點課題之一，正確控制褐變的方法對成功培養(yǎng)紅掌組織具有重大意義。在本次研究中，主要是探究與分析在培養(yǎng)紅掌組織的過程中的外植體褐變現(xiàn)象，通過采用不同添加物試驗處理及不同硬度培養(yǎng)基等研究方法，對科學合理的處理方式進行有效篩選，從而為后期組織培養(yǎng)提供科學有力的理論支持?？傊?，外植體褐變現(xiàn)象普遍存在于植物組織的培養(yǎng)中，應對褐變現(xiàn)象的發(fā)生機制進行深入分析與了解，從而找尋出適宜外植體的培養(yǎng)條件。

本研究表明，在形成紅掌愈傷組織的過程中，活性炭AC不是最佳防褐變劑。而通過添加聚乙烯吡咯烷酮，其褐變率為24%，僅次于活性炭，而愈傷誘導率高達76%，高于抗壞血酸VC、檸檬酸、葉酸。在上述5個添加物中，聚乙烯吡咯烷酮具有良好的處理成效，是最佳防褐變劑。

綜上所述，將0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP、4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L均添加到5g/L硬度的瓊脂MS培養(yǎng)基中，可在最大限度上對褐變現(xiàn)象進行有效控制，且提升愈傷誘導率。

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作者簡介：鄭萍，博士，農藝師，研究方向：遺傳育種。