不同玉米（Zea mays L.）品種根細(xì)胞壁多糖對(duì)Pb脅迫的響應(yīng)

沈奕昕，李元, ，祖艷群, ，湛方棟, ，陳建軍, *

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南省農(nóng)業(yè)環(huán)境污染控制與生態(tài)修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，重金屬污染愈發(fā)嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，2014年中國(guó)土壤重金屬超標(biāo)率為16.1%，而農(nóng)田土壤點(diǎn)位超標(biāo)率最高為19.4%（環(huán)境保護(hù)部等，2014）。中國(guó)每年因重金屬污染而減產(chǎn)的糧食超過(guò)1000×104t，同時(shí)有1200×104t左右的糧食受到重金屬污染，經(jīng)濟(jì)損失超過(guò) 200億元（左建華等，2013）。

阻止和排放作用以及區(qū)域化作用是植物應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的重要途徑之一（Taylor，1991；Kochian，1995；Kochian et al.，2004），早有報(bào)道指出，植株會(huì)將重金屬固定在根部而減少地上部分的重金屬含量，從而減輕重金屬對(duì)植物的傷害（Antosiewicz，1992），同時(shí)植株會(huì)將進(jìn)入根部的重金屬固定在其根部細(xì)胞壁中，阻止其進(jìn)入原生質(zhì)體從而減輕重金屬對(duì)植株的傷害（Lux et al.，2011；Vodnik et al.，1999）。細(xì)胞壁是累積重金屬的重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（Konno et al.，2010；Malecka et al.，2008），并且可以容納大量重金屬離子（Kopittke et al.，2008；Kopittke et al.，2007；Krzeslowska et al.，2009；Krzeslowska et al.，2010）。玉米（Zea mays L.）根細(xì)胞壁中Zn可達(dá)總量的42.8%，而Cu的占比甚至可以達(dá)到64.3%（周建民等，2005），而玉米根細(xì)胞壁中的Pb占比也可達(dá)到52.4%（秦麗，2017），可見(jiàn)植物根細(xì)胞壁在固定重金屬的過(guò)程中的重要性。

另外，植物體內(nèi)的重金屬存在形式和活性高低也在一定程度上決定了重金屬毒性的大小，反映了植物對(duì)重金屬的抗性。研究表明，同種植物不同品種植株體內(nèi)的重金屬化學(xué)提取態(tài)占比也有所不同，Cd的低累積品種水稻（Oryza sativa L.）中的水提取態(tài)和乙醇提取態(tài)等高活性Cd含量占比低于高累積品種，而低累積品種水稻中低活性的 NaCl提取態(tài) Cd含量高于高累積品種（于輝等，2008）。此外，包括玉米在內(nèi)的各種作物重金屬低累積品種篩選工作早已開(kāi)展，但對(duì)內(nèi)在機(jī)理的研究相對(duì)較少。本研究以玉米的籽粒Pb低累積品種和籽粒Pb高累積品種，通過(guò)水培試驗(yàn)，研究在 Pb脅迫下，兩個(gè)品種玉米根部 Pb化學(xué)形態(tài)和亞細(xì)胞分布的差異，及其根細(xì)胞壁 Pb累積與多糖響應(yīng)的差異，為將來(lái)玉米 Pb的低累積品種的培育與篩選工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為玉米“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在受Pb污染地塊（Pb全量為902 mg·kg-1）的田間試驗(yàn)中，兩個(gè)玉米品種表現(xiàn)出不同的Pb累積性，“路單8號(hào)”的籽粒Pb的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá) 1.89 mg·kg-1，“會(huì)單 4號(hào)”的籽粒Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.501 mg·kg-1（表1）。

表1 2個(gè)品種玉米中的鉛含量Table 1 Pb concentration in 2 cultivars of maize

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 植物材料的培養(yǎng)和準(zhǔn)備

玉米的培養(yǎng)及 Pb脅迫試驗(yàn)：取經(jīng)消毒處理、顆粒飽滿(mǎn)均勻的玉米種子，于培養(yǎng)箱中 28 ℃條件下催芽。挑選生長(zhǎng)強(qiáng)壯的玉米苗轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng) 7 d，再選取長(zhǎng)勢(shì)較好并相似的玉米植株，分別移入營(yíng)養(yǎng)液中，用同一型號(hào)的水桶培養(yǎng)，于3月置于大棚中培養(yǎng)（25°14′N(xiāo)，102°75′E），共分 3 組，分別為無(wú)鉛（對(duì)照組）、100 mg·L-1Pb脅迫組、300 mg·L-1Pb脅迫組，每組共設(shè)置9個(gè)平行。營(yíng)養(yǎng)液每隔1周更換1次，脅迫14 d后，取出后先用去離子水將植株根沖洗干凈，然后以 25 mL10 mmol·L-1EDTA溶液浸泡5 min，以去除根表吸附的Pb，然后再用去離子水將根沖洗干凈備用。營(yíng)養(yǎng)液：945 mg·L-1Ca(NO3)2·4H2O，506 mg·L-1KNO3，80 mg·L-1NH4NO3，1.36 mg·L-1KH2PO4，390 mg·L-1MgCl2，13.9 mg·L-1FeSO4·7H2O，18.7 mg·L-1Na2EDTA，8.3 μg·L-1KI，62 μg·L-1H3BO3，223 μg·L-1MnSO4，86 μg·L-1ZnSO4，2.5 μg·L-1Na2MoO4，0.25 μg·L-1CuSO4，0.25 μg·L-1CoCl2。

1.2.2 根組織內(nèi)Pb化學(xué)結(jié)合形態(tài)的提取分離

采用化學(xué)試劑逐步提取法（劉婷婷，2014）。5種提取劑（體積分?jǐn)?shù)為 80%的乙醇，去離子水，1 mol·L-1NaCl溶液，體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸，0.6 mol·L-1鹽酸）分別提取無(wú)機(jī)類(lèi)、氨基酸類(lèi)等可溶性鉛，水溶性有機(jī)酸鉛類(lèi)，與蛋白質(zhì)結(jié)合或吸著態(tài)的鉛及果膠酸鉛等，以及難溶于水的磷酸類(lèi)鉛、草酸鉛。

1.2.3 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離

采用分級(jí)離心法（Lozano-Rodriguez et al.，1997）分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 準(zhǔn)確稱(chēng)取鮮根0.500 g加入預(yù)冷的 20 mL 提取液（0.25 mmol·L-1蔗糖+50 mmol·L-1Tris-HC1 緩沖液(pH7.5)+10 mmol·L-1的二硫赤蘚糖醇），研磨勻漿，通過(guò)孔徑100 μm的尼龍網(wǎng)篩，殘?jiān)礊榧?xì)胞壁組分（F1）；上清液在12000 r·min-1下離心 30 min，沉淀即為細(xì)胞器（F2），上清液為包括質(zhì)體和液泡在內(nèi)的胞液（F3）；全部操作在4 ℃條件下進(jìn)行。

1.2.4 玉米根細(xì)胞壁的提取

采用粉碎細(xì)胞，抽提細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的方法（武貝，2009）取新鮮根系加入液氮在研缽中研磨至粉末，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的冰乙醇浸沒(méi)混勻，冰浴20 min后以12000 r·min-1離心10 min，去上清液后加入冰丙酮提取，冰浴20 min后再離心20 min，去上清液后加入1∶1的甲醇-∶氯仿提取，冰浴20 min后離心20 min，去除上清液，最后加入甲醇提取，冰浴20 min后離心20 min，去上清液后冷凍干燥。干燥完全后的固體殘余便是粗提細(xì)胞壁。提取完成后，干燥的細(xì)胞壁放入4 ℃冰箱中密封保存。以上操作試劑用量均為每克根鮮質(zhì)量加10 mL溶液。

1.2.5 玉米根細(xì)胞壁多糖組分的分離

參考Zhong et al.（1993）的方法進(jìn)行細(xì)胞壁多糖組分分離：稱(chēng)取0.100 g細(xì)胞壁樣品，在95 ℃下，加15 mL 0.5%草酸銨，提取3次，每次15 min，上清液即為果膠物質(zhì)。提取果膠后的沉淀分別用4%KOH和24%KOH（含0.02% NaBH4）提取，共提取3次，每次12 h，10000 r·min-1離心15 min，4%和24%KOH提取物分別為半纖維素1類(lèi)和半纖維素2類(lèi)。半纖維素1類(lèi)和半纖維素2類(lèi)在冰浴條件下用冰乙酸中和，堿性不溶物質(zhì)即為纖維素類(lèi)。

1.3 樣品指標(biāo)的測(cè)定

Pb含量的測(cè)定：均采用 HNO3-HClO4法消解-石墨爐/火焰原子吸收分光光度法測(cè)定亞細(xì)胞組分、化學(xué)提取態(tài)組分、細(xì)胞壁各多糖組分中 Pb含量。細(xì)胞壁各多糖的總糖含量測(cè)定：以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)采用苯酚硫酸比色法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel做表、SPSS數(shù)據(jù)分析、Origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb在玉米根中的亞細(xì)胞分布

表2顯示，在Pb脅迫下，“會(huì)單4號(hào)”根部細(xì)胞壁中Pb占比為51.5%～55.8%，細(xì)胞器中的Pb占比為 26.1%～42.6%，可溶態(tài) Pb占比為5.86%%～18.1%；在Pb脅迫下，“路單8號(hào)”根部細(xì)胞壁中Pb占比為48.9%～52.2%，細(xì)胞器中的Pb占比為 38.1%～45.3%，可溶態(tài) Pb占比為5.80%%～9.64%。由此可見(jiàn)，玉米植株根細(xì)胞壁對(duì)Pb有較強(qiáng)的累積能力，通過(guò)細(xì)胞壁對(duì)Pb的沉淀作用，減輕 Pb對(duì)玉米植株的毒害，這是玉米植株增強(qiáng)自身對(duì)Pb抗性的重要手段之一。與低濃度Pb脅迫相比，高濃度Pb脅迫下“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”的細(xì)胞壁、可溶態(tài) Pb占比升高，而細(xì)胞器中Pb的占比降低。在同濃度Pb脅迫下，“會(huì)單4號(hào)”根中細(xì)胞壁及可溶態(tài) Pb質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于“路單8號(hào)”。這表明，作為低累積品種的“會(huì)單4號(hào)”，其根細(xì)胞壁吸附累積Pb的能力強(qiáng)于高累積品種“路單8號(hào)”。

2.2 玉米根細(xì)胞中Pb的化學(xué)形態(tài)

由圖1可知，無(wú)論是在低濃度Pb還是高濃度Pb脅迫下，“會(huì)單 4號(hào)”根中，Pb主要以 NaCl提取態(tài)和 HAc提取態(tài)存在，分別達(dá)到32.3%～34.8%、43.7%～56.0%；其后依次為 HCl提取態(tài)、去離子水提取態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)和乙醇提取態(tài)，其中活性較強(qiáng)的去離子水提取態(tài)和乙醇提取態(tài)只占據(jù) 2.73%～5.04%。而“路單 8號(hào)”根中，Pb也以NaCl提取態(tài)和 HAc提取態(tài)為主，分別達(dá)到47.1%～48.1%、44.0%～48.6%；其后依次為去離子水提取態(tài)、HCl提取態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)和乙醇提取態(tài)，其中活性較強(qiáng)的去離子水提取態(tài)和乙醇提取態(tài)只占據(jù)了2.97%～4.39%。由此可見(jiàn)，Pb被植株吸收后，玉米會(huì)通過(guò)蛋白質(zhì)、果膠酸、磷酸、草酸等與 Pb相結(jié)合，將高活性 Pb轉(zhuǎn)化為較低活性的形態(tài)，由此來(lái)降低Pb的毒害，增強(qiáng)自身對(duì)Pb的抗性，這在兩個(gè)品種玉米上都有體現(xiàn)。

圖1 鉛脅迫下，玉米根部各個(gè)化學(xué)形態(tài)鉛的占比Fig. 1 Proportion of different chemical fractions of Pb in the roots of mazie under Pb stress

2.3 玉米根細(xì)胞壁各多糖組分總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由圖2可知，隨著Pb脅迫濃度的升高，“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”根細(xì)胞壁果膠總糖含量明顯上升，半纖維素2總糖含量變化不顯著；相比對(duì)照組，在低濃度Pb處理下，“會(huì)單4號(hào)”的半纖維素1總糖無(wú)顯著變化，“路單8號(hào)”出現(xiàn)顯著降低，在高濃度Pb處理下，“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”的半纖維素總糖含量都出現(xiàn)顯著降低。同一處理下“會(huì)單4號(hào)”的果膠總糖含量顯著高于“路單8號(hào)”，“路單8號(hào)”的半纖維素1和半纖維素2總糖含量略高于“會(huì)單4號(hào)”。其中，相較于對(duì)照組，低濃度Pb脅迫下“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”的果膠總糖含量分別上升了23.5%、27.5%；高濃度Pb脅迫下，兩者分別上升了71.0%、67.0%。這表明，玉米植株根部對(duì) Pb脅迫作出了響應(yīng)，而根細(xì)胞壁果膠含量的升高是應(yīng)對(duì)Pb脅迫的手段之一。

表2 鉛脅迫下，鉛在玉米根細(xì)胞的亞細(xì)胞組分中的分布Table 2 Subcellular distribution of Pb in the roots of maizes under Pb stress

圖2 玉米根細(xì)胞壁各多糖組分總糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 2 Total sugar concentration of polysaccharide compositions in cell wall of maize roots

2.4 玉米根細(xì)胞壁各多糖組分中Pb的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖3 鉛脅迫下，玉米根細(xì)胞壁各多糖組分中鉛含量Fig. 3 Total Pb concentration of polysaccharide compositions in root cell wall of maize under Pb stress

對(duì)照組（無(wú)Pb環(huán)境）玉米未檢出Pb，故未在圖3中展現(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)。圖3顯示，無(wú)論是在高濃度Pb脅迫還是低濃度Pb脅迫下，兩個(gè)品種玉米根細(xì)胞壁多糖組分均以果膠中的 Pb含量最高，其次是纖維素。低濃度Pb脅迫下，“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”果膠中Pb含量分別占總量的68.1%、55.6%，纖維素中Pb含量分別占24.5%、34.6%；高濃度Pb脅迫下，兩者果膠中Pb含量分別占79.5%、77.3%，纖維素中Pb含量分別占17.2%、18.9%。無(wú)論是“會(huì)單4號(hào)”還是“路單8號(hào)”，在高濃度Pb脅迫下，果膠和纖維素中的Pb含量都顯著高于低濃度Pb脅迫下的，而半纖維素中 Pb含量差異不顯著。結(jié)果表明，玉米根細(xì)胞壁的果膠、半纖維素 1、半纖維素2、纖維素在細(xì)胞壁吸附累積Pb的過(guò)程中都有一定的貢獻(xiàn)，以果膠的貢獻(xiàn)最大。而在相同濃度 Pb脅迫下，“會(huì)單4號(hào)”的果膠中的Pb含量顯著高于“路單8號(hào)”，而其他3個(gè)組分Pb含量量差異不顯著。綜上，低累積玉米“會(huì)單4號(hào)”和高累積玉米“路單8號(hào)”的根細(xì)胞壁吸附Pb的能力差異主要體現(xiàn)在果膠上。

3 討論

細(xì)胞壁是鉛進(jìn)入植物細(xì)胞的第一道屏障，也是累積重金屬離子的重要亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（Wójcik et al.，2005；Islam et al.，2007）。玉米根細(xì)胞壁可以吸附31.1%～40.5%總Cu（司江英等，2008），本試驗(yàn)結(jié)果與之類(lèi)似，從表2可知，在Pb脅迫下，玉米根細(xì)胞壁吸附的 Pb的量可以達(dá)到總量的48.9%～55.8%。一般而言，進(jìn)入植物根細(xì)胞的重金屬，一部分會(huì)被植株固定在根部而滯留，另一部分會(huì)通過(guò)共生質(zhì)體途徑進(jìn)入導(dǎo)管組織中，隨著蒸騰作用被運(yùn)送到植株的地上部分，然后分布于植株的莖、葉、果實(shí)、種子中，而根細(xì)胞壁對(duì)重金屬的沉淀作用一方面可以降低部分進(jìn)入植物體內(nèi)重金屬的活性（楊錦忠，2000），另一方面可以減少其進(jìn)入原生質(zhì)體以及向地上部分轉(zhuǎn)移的量，從而減輕重金屬的毒害作用（Jiang et al.，2008；Lux et al.，2011）。因此，玉米根細(xì)胞壁在玉米植株應(yīng)對(duì) Pb脅迫時(shí)扮演了重要角色。另外，“會(huì)單4號(hào)”根部細(xì)胞壁對(duì)Pb的吸附能力強(qiáng)于“路單8號(hào)”，因此，“會(huì)單4號(hào)”的這道保護(hù)原生質(zhì)體的屏障（細(xì)胞壁）的阻滯能力更強(qiáng)。相比“路單8號(hào)”，根細(xì)胞壁對(duì)Pb更強(qiáng)的阻滯能力一定程度上能降低“會(huì)單4號(hào)”根部向地上部分運(yùn)送的Pb的量，使其籽粒中的Pb含量維持在較低的水平，

研究認(rèn)為，不同種類(lèi)的植物以及同種植物不同品種其體內(nèi)的重金屬化學(xué)提取態(tài)占比有所不同（于輝等，2008；徐劼等，2011）。程海寬等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，不同玉米品種體內(nèi)Pb的化學(xué)形態(tài)占比不同，但均以鹽酸提取態(tài)和醋酸提取態(tài)為主，其中品種“圣瑞568”根部乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)的 Pb只占 8.1%～10.9%。本研究也有類(lèi)似的結(jié)果，圖 1顯示，兩個(gè)品種玉米根部Pb均以NaCl提取態(tài)和HAc為主，去離子水提取態(tài)和乙醇提取態(tài)Pb含量只占據(jù)總量的2.73%～5.04%。低活性態(tài)Pb主要以難溶性的蛋白結(jié)合態(tài)、果膠酸鹽、磷酸鹽結(jié)合態(tài)和草酸鹽等形式存在，其遷移能力和毒性都比乙醇和水提取態(tài) Pb弱得多（陸仲煙等，2013；楊素勤等，2015）。由此表明，在Pb脅迫下，“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”均可控制其體內(nèi)的Pb，使其從毒性較大、活性較高的可溶態(tài)Pb向低毒、低活性的形態(tài)轉(zhuǎn)化，以此增加自身對(duì)Pb的抗性。另外，兩個(gè)品種的玉米根部中NaCl提取態(tài)的Pb含量較高，由此表明，“會(huì)單4號(hào)”和“路單8號(hào)”根部有大量的Pb與蛋白和果膠酸結(jié)合，果膠極可能在玉米根部固定Pb的過(guò)程中起了重要作用。

植物初生細(xì)胞壁中多糖占比可達(dá)90%（Gibeaut et al.，1993），細(xì)胞壁多糖組分主要為纖維素、半纖維以及果膠。有研究發(fā)現(xiàn)，植物會(huì)通過(guò)增加細(xì)胞壁中多糖含量的方式來(lái)應(yīng)對(duì)重金屬的脅迫（陳佳，2008；Hossain et al.，2005；Andrade et al.，2010；劉家友等，2009）。圖2與圖3顯示，在Pb脅迫下，玉米根細(xì)胞壁中果膠含量都顯著升高，而果膠中的Pb含量也隨之升高，但半纖維素1和半纖維素2的總糖有略微下降，并且半纖維素1和2中的Pb含量也未出現(xiàn)明顯升高。這表明根細(xì)胞壁果膠含量的上升是玉米植株應(yīng)對(duì) Pb脅迫的策略之一。果膠富含負(fù)電基團(tuán)，這些基團(tuán)能結(jié)合包括Pb2+在內(nèi)的多種重金屬離子（Davis et al.，2003；Kartel et al.，1999），根細(xì)胞壁果膠含量的升高可以增加細(xì)胞壁上Pb的結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)細(xì)胞壁對(duì)Pb的沉積作用，減弱Pb的毒性，增強(qiáng)玉米對(duì)Pb的抗性。這與Yang et al.（2008）發(fā)現(xiàn)水稻吸附 Al的能力與果膠水平相關(guān)的結(jié)果是類(lèi)似的。另有研究也有類(lèi)似的結(jié)果，茶樹(shù)（Camellia sinensis L.）根細(xì)胞壁中果膠可以吸附 34%的 Pb（王夢(mèng)，2014），在 Al濃度低于 32 μmol·L-1時(shí)，果膠酸鹽可吸附溶液中 70%～84%的Al（Matsumoto，2000），可見(jiàn)果膠在根細(xì)胞壁吸附固定 Pb過(guò)程中具有重要作用。在玉米品種間差異方面，從圖2和圖3可知，在同一處理下，“會(huì)單4號(hào)”的果膠總糖含量明顯高于“路單8號(hào)”，而在同一濃度Pb脅迫下，“會(huì)單4號(hào)”的果膠中Pb含量顯著高于“路單8號(hào)”，其他多糖的Pb含量并未出現(xiàn)明顯的品種差異，不難發(fā)現(xiàn)“會(huì)單4號(hào)”與“路單8號(hào)”根細(xì)胞壁吸附Pb的量的差異主要體現(xiàn)在果膠上，玉米根細(xì)胞壁結(jié)合 Pb的能力可能與果膠水平相關(guān)。

總之，果膠作為玉米根細(xì)胞壁重要組分之一，在玉米植株降低Pb活性——細(xì)胞壁對(duì)Pb的沉淀作用中扮演了重要的角色，而 Pb的高低累積玉米品種間，細(xì)胞壁吸附累積 Pb的能力差異也主要體現(xiàn)在果膠上，至于果膠為何能發(fā)揮如此重要的作用，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和探討。

4 結(jié)論

玉米通過(guò)增加根細(xì)胞壁果膠的方式來(lái)應(yīng)對(duì)Pb的脅迫。Pb的低累積品種“會(huì)單4號(hào)”根細(xì)胞壁吸附累積Pb的能力強(qiáng)于高累積品種“路單8號(hào)”，而這種差異主要體現(xiàn)在果膠對(duì)Pb的吸附量上。另外，玉米細(xì)胞壁結(jié)合Pb的能力很可能與果膠水平相關(guān)。

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