CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在鏈霉菌中的應(yīng)用

喬龍亮 龐建虎 黨晨陽 黃海龍 朱鵬

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

鏈霉菌（Streptomyces）是革蘭氏陽性放線菌，能產(chǎn)生大量具有重要價值的天然代謝產(chǎn)物，在工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療方面有著重要地位。目前臨床應(yīng)用的抗生素約2/3來源于鏈霉菌屬［1］，如殺蟲藥（阿維菌素和米爾貝霉素），抗菌素（紅霉素和萬古霉素），此外，該屬菌株還可以產(chǎn)生抗腫瘤藥（柔紅霉素和博來霉素）及免疫抑制劑（FK506、FK520和雷帕霉素）等。目前對鏈霉菌代謝產(chǎn)物的研究多集中在抗生素領(lǐng)域，由于人類對抗生素的長期使用，從而出現(xiàn)大量多藥耐藥菌，為解決此問題，開發(fā)新的有效抗生素已成為當(dāng)務(wù)之急［2-3］。鏈霉菌的全基因組測序顯示鏈霉菌中存在許多隱性次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇（Cryptic secondary metabolite biosynthetic gene cluster，CSMG），在實(shí)驗(yàn)室條件下，它們多數(shù)處于沉默狀態(tài)或者很低的表達(dá)水平，通過有效的分子操作方法來激活CSMG獲得新抗生素類型已成為一個重要的研究方向［4］。

與模型菌株（如大腸桿菌和釀酒酵母）相比，鏈霉菌的遺傳操作更加困難，部分原因是它們的基因組是目前原核生物中最大的，且基因組中GC含量極高。目前在鏈霉菌的遺傳操作是十分有限的，主要分為有痕敲除方法和無痕敲除方法。早在2003年，Gust課題組［5］首次將λ-red重組系統(tǒng)應(yīng)用于構(gòu)建鏈霉菌敲除載體，但得到的目的菌株染色體上含有抗性篩選標(biāo)記，不利于進(jìn)行連續(xù)敲除。此后基于無痕敲除理念發(fā)展的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)已經(jīng)成為高通量遺傳分析中有利和高效的手段，并得到廣泛應(yīng)用。目前在鏈霉菌中已得到應(yīng)用的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)有Cre/loxp系統(tǒng)、Dre/rox系統(tǒng)、Flp/FRT系統(tǒng)和Int-Xis系統(tǒng)（表1），但這些傳統(tǒng)的基因編輯手段的缺點(diǎn)也十分明顯，如效率低、實(shí)驗(yàn)周期長以及操作步驟繁瑣等。而近年來，素有“魔剪”之稱的規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9（CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)因其不具有上述所有缺點(diǎn)，迅速席卷全球?qū)嶒?yàn)室，且被Science雜志評為2013年度最重要的科學(xué)突破之一。

表1 目前應(yīng)用于鏈霉菌基因組編輯的方法［6-10］

一個典型的CRISPR-Cas9基因座結(jié)構(gòu)分為3部分（圖1）：3'端是由多個重復(fù)序列（Repeat）與非重復(fù)間隔序列（Spacer）構(gòu)成的CRISPR基因座；5'端是可轉(zhuǎn)錄為反式激活crRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）的區(qū)域；中間部分由成簇的Cas基因組成，主要包括cas1、cas2和cas9。cas9編碼蛋白具有核酸酶、解旋酶和聚合酶等功能。CRISPR/Cas9作為細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫機(jī)制，經(jīng)人為改造后，可在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯。該系統(tǒng)通過設(shè)計(jì)特異性向?qū)NA（Single guide RNA，sgRNA）序列與靶序列堿基配對，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到靶序列處，行使DNA切割功能，再利用細(xì)胞的非同源性末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（Homologous recombina-tion，HR）修復(fù)機(jī)制對斷裂的DNA進(jìn)行插入缺失（Indel）、修復(fù)（Repair）或替換（Replacement）（圖2）。此外，當(dāng)RuvC結(jié)構(gòu)域和HNH結(jié)構(gòu)域同時處于失活狀態(tài)時（D10A&H840A），Cas9將不具有核酸酶活性，成為dCas9（dead Cas9）［11］，但仍能作為基因編輯工具，達(dá)到沉默基因效果。本文通過比較常規(guī)基因編輯技術(shù)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)，說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中應(yīng)用的優(yōu)勢，綜述近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中的應(yīng)用，并對其應(yīng)用潛力進(jìn)行梳理，以期為相關(guān)領(lǐng)域的工作提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中應(yīng)用的優(yōu)勢

CRISPR/Cas9系統(tǒng)從細(xì)菌和古細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄏ蚧蚓庉嫾夹g(shù)后，因其快速、高效、廉價和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)使之迅速成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)工具。目前在鏈霉菌的常規(guī)遺傳操作主要分為有痕敲除方法和無痕敲除方法。

圖1 三種不同CRISPR/Cas9亞型的基因結(jié)構(gòu)

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因編輯示意

對于有痕敲除方法，其缺點(diǎn)比較突出，每次敲除基因之后都會在染色體基因組上引入一個篩選標(biāo)記，不利于進(jìn)行連續(xù)敲除，而且抗性基因的插入還會影響靶基因下游基因的表達(dá)［12］?；跓o痕敲除理念發(fā)展的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包括：Cre/loxp系統(tǒng)、Flp/FRT系統(tǒng)、Dre/rox系統(tǒng)和Int/Xis系統(tǒng)（表1）。它們在鏈霉菌中的應(yīng)用各有千秋，但缺點(diǎn)也都類似，其中Cre/loxp系統(tǒng)、Dre/rox系統(tǒng)和Int/Xis系統(tǒng)每進(jìn)行一次敲除染色體上會留下1個位點(diǎn)（loxp、rox、att1），連續(xù)進(jìn)行多次敲除后會造成染色體的不穩(wěn)定，因其步驟繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長達(dá)6周。Flp/FRT系統(tǒng)由于flp基因GC含量太低，無法在鏈霉菌中表達(dá)，Gust等［5］將Flp-FRT系統(tǒng)和λ-red重組系統(tǒng)結(jié)合組成為PCR-Targeting方法對鏈霉菌的基因進(jìn)行敲除，但效率只有40%［13］。另外，在實(shí)驗(yàn)周期方面至少需要花費(fèi)3周時間。使用內(nèi)切核酸酶I-SceI可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)大片段基因敲除，但該方法尚需較長周期才能完成。而使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以極大地簡化實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)周期縮短至17 d［14］。另外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)既能敲除小的單個基因，也能敲除大的基因片段，如NRPS或PKS的整個基因簇，甚至能同時敲除多個基因，而且具有較高的效率和準(zhǔn)確度，此前報道的其他方法是無法實(shí)現(xiàn)的［15］。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中的應(yīng)用

模式生物因其基因組已被測序且代謝通路研究較為清晰，可以為研究CRISPR/Cas9的編輯作用以及效率提供很好的樣本。目前，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在幾乎所有的模式生物中實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除和編輯，在鏈霉菌中也有6種，分別為變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）、綠色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces.viridochromogenes）， 白 色 鏈 霉 菌（Streptomyces albus）、天藍(lán)色鏈霉菌［Streptomyces coelicolor A3（2）］、天 藍(lán) 色 鏈 霉 菌（Streptomyces coelicolorM145）、玫 瑰 孢 鏈 霉 菌（Streptomyces roseosporusNRRL15998），其中較為廣泛研究的是天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）。普遍利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中對目的基因的敲除策略如圖3，將根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的sgRNA和cas9基因以及靶基因的上下游同源臂整合在同一質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入鏈霉菌體內(nèi)，利用轉(zhuǎn)錄的sgRNA引導(dǎo)cas9蛋白對靶基因進(jìn)行切割，隨后與上下游同源臂進(jìn)行交換完成基因敲除。值得注意的是，由于化膿性鏈球菌cas9基因存在幾種稀有密碼子，其中有許多bldA密碼子，bldA編碼鏈霉菌中能有效識別稀有UUA亮氨酸密碼的tRNA，該tRNA通過控制稀有密碼子UUA的翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［16］，除了bldAtRNA以外，UUA密碼子不能被其他的tRNA有效翻譯。因此，在鏈霉菌中應(yīng)用的cas9基因都需經(jīng)過密碼子優(yōu)化。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中的驗(yàn)證

圖3 敲除目的基因簇的策略

2.1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中具有編輯作用，2014年，Cobb等［15］首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于鏈霉菌。他們構(gòu)建兩種不同的質(zhì)粒，pCRISPomyces-1質(zhì)粒包括tracrRNA（由rpsLp（CF）驅(qū)動）、CRISPR陣列表達(dá)盒（由gapdhp（EL）驅(qū)動）及cas9基因；pCRISPomyces-2質(zhì)粒包括sgRNA表達(dá)盒（由gapdhp（EL）驅(qū)動）和cas9基因，兩種質(zhì)粒中cas9基因均由啟動子rpsLp（XC）-BbsI驅(qū)動。為驗(yàn)證兩種質(zhì)粒在鏈霉菌中行使編輯功能的效果，以變鉛青鏈霉菌為研究對象，針對十一烷基靈菌紅素（Undecylprodigiosin）合成途徑中的redN基因和放線菌紫素（Actinorhodin）合成途徑中的actVAORF5基因做敲除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pCRISPomyces-1質(zhì)粒的敲除效率只有25%左右，而pCRISPomyces-2質(zhì)粒無論對單基因敲除還是對多個單基因同時敲除都能達(dá)到100%的效率。另外，Cobb等還使用pCRISPomyces-2對綠色產(chǎn)色鏈霉菌的phpD和phpM基因以及白色鏈霉菌的sshg_05713和sshg_00040/sshg_00050進(jìn)行敲除，效率達(dá)66%-100%。這也側(cè)面說明pCRISPomyces-2在鏈霉菌中能夠普遍適用。

Tong等［17］以溫敏型質(zhì)粒pGM1190為骨架，通過改造設(shè)計(jì)成pCRISPR-Cas9質(zhì)粒，pCRISPR-Cas9中以tipA啟動子驅(qū)動cas9/dcas9表達(dá)，PermE*啟動子驅(qū)動sgRNA轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯。通過靶向天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor A3（2））放線紫紅素合成途徑中的兩個基因：actIORF1（SCO5087）和actVB（SCO5092）敲除去驗(yàn)證上述系統(tǒng)的可行性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沒有同源修復(fù)模板時，CRISPR/Cas9系統(tǒng)完成對DNA的雙鏈切割后，通過機(jī)體內(nèi)NHEJ機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，在靶基因中產(chǎn)生一系列不同的突變體，刪除效率為3%-54%，相比真核生物偏低［18］。ligase D（LigD）是NHEJ途徑中的一個核心元件，絕大多數(shù)鏈霉菌中缺少該元件，作者將來源于肉色鏈霉菌（Streptomyces carneus）的LigD整合入pCRISPR-Cas9體系，顯著提高了刪除效率（77%）；而提供同源修復(fù)模板，CRISPR/Cas9系統(tǒng)完成對DNA的雙鏈切割后，機(jī)體通過HDR機(jī)制進(jìn)行修復(fù)可以實(shí)現(xiàn)100%的精確刪除。

Huang等［14］以原始質(zhì)粒pKC1139為骨架設(shè)計(jì)含CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒，其中，cas9基因由啟動子tipA負(fù)責(zé)驅(qū)動，sgRNA的轉(zhuǎn)錄是由合成啟動子j23119驅(qū)動。將其轉(zhuǎn)入天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolorM145）中進(jìn)行基因敲除，單個基因（actII-orf4、redD、glnR）敲除效率達(dá)到60%-100%。有意思的是，根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的不同sgRNA和培養(yǎng)基成分的變化對敲除效率都有不同程度的影響。同時敲除多個單基因（actII-orf4和redD）時，效率有所下降，但也達(dá)到54%。

目前在鏈霉菌中常使用內(nèi)切核酸酶I-SceI對大片段基因進(jìn)行敲除，但該方法步驟十分繁瑣。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能否也實(shí)現(xiàn)同樣功能，且效率如何，Huang等給出了答案，針對放線紫紅素、十一烷基靈菌紅素、鈣依賴抗生素合成途徑的基因簇（Sco5071-5092、Sco5877-5898、Sco3210-3250） 敲除效率達(dá)54%-100%，且對多個基因簇共同敲除效率也達(dá)45%±8%。

CodA（sm）是胞嘧啶脫氨酶的D314A突變體，可以將培養(yǎng)基中添加的無毒性5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5FC）轉(zhuǎn)化成有毒5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5FU），可以被用來篩選已突變而且質(zhì)粒被清除的個體。在2009年，Dubeau等［19］首次將CodA（sm）作為鏈霉菌的一個反選擇標(biāo)記。2015年，Hu等［20］將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與CodA（sm）結(jié)合應(yīng)用于鏈霉菌。他們以Streptomyces coelicolorM145中放線菌素合成途徑中actI-ORF2基因?yàn)榍贸龑ο?，?gòu)建了6種不同的質(zhì)粒，使用強(qiáng)啟動子ermE*驅(qū)動sgRNA轉(zhuǎn)錄，同源修復(fù)模板為靶基因的上下游基因（UHA+DHA），其中不含sgRNA的質(zhì)粒pWHU2656只通過同源交換，靶基因的敲除率為4%。質(zhì)粒pWHU2657（scas9，sgRNA2（+48），UHA+DHA）對靶基因敲除率為93%，比pWHU2658（scas9，sgRNA2（+85），UHA+DHA）敲除率99%略低一些。將codA（sm）基因插入pWHU2659，隨后把40個有安普霉素抗性重組子轉(zhuǎn)到含有800 μg/mL 5FC的SFM培養(yǎng)基中，在135個存活子中有127個是重組子且無質(zhì)粒，這大大縮減了后期篩選無質(zhì)粒的突變子的周期。

雍德祥［21］通過對維吉尼亞鏈霉菌IBL14（Streptomyces virginiaeIBL14）的全基因組序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)并確定了其中的CRISPR系統(tǒng)屬于I-B型并將其命名為CRISPR I-SV14B系統(tǒng)，選取設(shè)計(jì)一段引導(dǎo)DNA以及同源臂整合到質(zhì)粒pKC1139上，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化到IBL14中進(jìn)行打靶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明svu016基因成功地被敲除掉，且效率為70%以上。

2.1.2 CRISPRi在鏈霉菌中的驗(yàn)證 CRISPR干擾（CRISPRi）是一項(xiàng)基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的新型基因調(diào)控工具，在某些情況下，可逆抑制基因表達(dá)策略優(yōu)于基因缺失［17］。Tong等［17］以actIORF1基因?yàn)轵?yàn)證對象，利用CRISPRy軟件對actIORF1基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)6種sgRNA和利用sgRNAcas9軟件對actIORF1啟動子區(qū)域設(shè)計(jì)6個sgRNA，其中一半靶向模板鏈DNA，另外一半靶向非模板鏈（圖4），研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論當(dāng)sgRNA靶向啟動子區(qū)域模板鏈或非模板鏈，放線菌素合成顯著降低甚至喪失。靶向ORF區(qū)域的重組子中，僅當(dāng)sgRNA靶向非模板鏈時才觀察到放線菌素量降低或者喪失。作者為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否可逆，將重組子在37℃下培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組子重新獲得放線菌素合成能力。證明了CRISPRi在鏈霉菌中應(yīng)用的可行性。

圖4 用于CRISPR干擾的12個sgRNA的位置

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌中的應(yīng)用

2.2.1 基因定點(diǎn)突變 定點(diǎn)突變通常包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變，它不僅可以用來闡明基因的調(diào)控機(jī)理，也可以用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。目前常用的技術(shù)包括：寡核苷酸式誘變、寡核苷酸引物介導(dǎo)、重疊延伸介導(dǎo)和大引物誘變法介導(dǎo)（PCR介導(dǎo)）等。但這些方法均存在很明顯的缺點(diǎn)。例如，成本高、突變效率低及操作復(fù)雜等。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)因其操作方便、突變效率高等優(yōu)點(diǎn)為基因定點(diǎn)突變提供了新的契機(jī)。

核糖體蛋白S12（由rpsL基因編碼）的位點(diǎn)特異性突變使得天藍(lán)色鏈霉菌對鏈霉素具有高的抗性（100 μg/mL）［22］。Huang［14］通過在同源修復(fù)模板上將原rpsL基因中262-264位的AAG改為GAA，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)成功實(shí)現(xiàn)基因點(diǎn)突變，突變效率達(dá)64%±12.7%，后期在含有100 μg/mL鏈霉素的平板中發(fā)現(xiàn)有菌落產(chǎn)生。

2.2.2 驗(yàn)證基因功能Streptomyces formicae是分離于非洲彭日格細(xì)長蟻（Tetraponera penzigiplant-ants）體內(nèi)的一種新的鏈霉菌種，其能產(chǎn)生對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA）和萬古霉素耐藥腸球菌（Vancomycin resistantenterococci，VRE）有活性的新型五環(huán)聚酮化合物。Qin等［23］通過對S. formicae產(chǎn)物鑒定分析發(fā)現(xiàn)，16種新的化合物分子，這些化合物具有一個核心結(jié)構(gòu)Formicamycins。接著利用antiSMASH 3.0對S. formicae基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其僅存在一個二型聚酮合酶基因簇（BGC30）。隨后將pCRISPomyces-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入S. formicae中，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)下將整個BGC30敲除，后期利用LC-MS（UV）檢測突變株均無Formicamycins產(chǎn)生。為了確定Formicamycins合成途徑丟失是由于基因編輯造成，而不是由其他突變事件造成，Qin等通過對突變株回補(bǔ)含BGC30質(zhì)粒，利用LCMS（UV）檢測突變株發(fā)現(xiàn)突變株重新產(chǎn)生Formicamycins，至此，他們利用CRISPR/Cas9編輯工具確認(rèn)Formicamycins是由二型聚酮合酶基因簇編碼產(chǎn)生。

Formicamycin結(jié)構(gòu)中含有4個鹵素原子，在BGC30中僅存在一個單基因（forV）疑似編碼鹵化酶，另外在S. formicae基因組中還存在2個疑似編碼鹵化酶。為了鑒定ForV的生物功能，Qin等［23］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將其敲掉，LC-MS（UV）檢測發(fā)現(xiàn)無Formicamycin產(chǎn)生，從而驗(yàn)證了forV負(fù)責(zé)Formicamycin結(jié)構(gòu)中鹵素原子的引進(jìn)。

2.2.3 激活鏈霉菌中隱性次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇 作為一類常見的細(xì)菌，鏈霉菌被用來產(chǎn)生很多作為抗生素、抗癌試劑和其他藥物的化合物。然而近年來對抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，使得臨床可用的有效抗生素越來越少。鏈霉菌的全基因組測序顯示鏈霉菌中存在許多隱性次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，在實(shí)驗(yàn)室條件下，它們多數(shù)處于沉默狀態(tài)或者很低的表達(dá)水平，通過激活CSMG獲得新抗生素已成為一個重要的研究方向。目前激活鏈霉菌CSMG的方法主要有：（1）改變發(fā)酵條件［24-25］；（2）核糖體工程及相關(guān)策略［26］；（3）聯(lián)合培養(yǎng)［27-28］；（4）異源表達(dá)［29-30］；（5）遺傳改造CSR（Cluster-situated regulator）基因［31-32］。在一項(xiàng)新的研究中，來自美國伊利諾伊大學(xué)和新加坡科技研究局的研究人員利用CRISPR-Cas9技術(shù)激活鏈霉菌中不表達(dá)的或者說沉默的基因簇［33］。

玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporusNRRL15998）的基因組經(jīng)比對分析，其包含29個生物合成基因簇（Biosynthetic gene clusters，BGCs）［34］，其中一個BGC與灰色鏈霉菌的PTM（Polycyclic tetramate macrolactam）基因簇序列相似性大于90%，Zhang等［33］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)將kasO*p插在第一個ORF的上游，成功地獲得了一種新的化合物PTM2。FR-900098是只能由微紅鼠灰鏈霉菌（Streptomyces rubellomurinus）和淡紫鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）產(chǎn)生的一種抗瘧藥，Zhang等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)將雙向P8-kasO*p啟動子盒引入玫瑰孢鏈霉菌膦酸鹽生物合成基因簇中，促使frbD操縱子和frbC同源物表達(dá)，在發(fā)酵產(chǎn)物中成功得到FR-900098，只是濃度低于微紅鼠灰鏈霉菌的發(fā)酵液。隨后，他們利用同樣的方法在綠色產(chǎn)色鏈霉菌中將kasO*p插入到一個II型PKS基因簇的最前端，成功激活BGC表達(dá)，產(chǎn)生一種新的化合物 4（C23H16O8）。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌應(yīng)用的潛力

晶體學(xué)技術(shù)為解析蛋白結(jié)構(gòu)和分子作用機(jī)制提供很好的手段，從而幫助人們對Cas9酶進(jìn)行優(yōu)化，使其可以完美發(fā)揮基因編輯效果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在行使基因編輯功能時，cas9中C端結(jié)構(gòu)域（PAM-interacting，PI）起著特異性識別作用，不同的PI識別不同的PAM區(qū)，具有專一性，但這限制了其可靶向序列的范圍。目前應(yīng)用最為普遍的化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）和金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9），其識別的PAM序列分別為 5'-NGG-3'和5'-NNGRRT-3'。基于PI對PAM的特異性具有決定作用，在2015年，Kleinstiver［35-36］研究小組分別對SpCas9和SaCas9進(jìn)行改造，共得到3種SpCas9突變體和1種SaCas9突變體，它們可以識別更廣泛的核苷酸序列，靶向以往CRISPR-Cas9技術(shù)無法觸及的基因組位點(diǎn)，同樣，其他一些研究小組也獲得了成功［37］（表2）。此項(xiàng)研究擴(kuò)大了CRISPR-Cas9工具箱的靶向空間，為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在鏈霉菌或其他物種中應(yīng)用提供了更多的可能性。

表2 幾種不同cas9的信息

4 問題與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然能夠高效快速地進(jìn)行基因編輯，為基礎(chǔ)研究提供了強(qiáng)大的平臺。但該技術(shù)的也存在一個最大的缺點(diǎn)即脫靶效應(yīng)，所謂“脫靶效應(yīng)”［49］，簡單來說，就是編輯了“預(yù)想之外”的基因，帶來各種不可控的不良后果。最近，發(fā)表在Nature Methods雜志上題為“Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editingin vivo”的論文稱，CRISPR能夠引入數(shù)百種意想不到的突變到基因組中［50］，但由于其樣本量選擇問題受到很多專家質(zhì)疑。值得慶幸的是，最近的研究表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)菌中是特異的，而且在鏈霉菌中目前也未有報道有關(guān)脫靶問題。在其他物種中針對脫靶問題，近年來科學(xué)家們研發(fā)了不少檢測脫靶剪切酶活性的實(shí)驗(yàn)方法，比如 GUIDE-seq［51］、Digenome-seq［52］、基于整合酶缺陷型慢病毒載體（IDLV）的技術(shù)［53］、BLESS［54］、SITE-Seq［55］、CIRCLE-seq［56］，這些方法各有優(yōu)劣勢，但都可以很好地預(yù)測潛在的脫靶位點(diǎn)。

鏈霉菌能夠產(chǎn)生多種抗生素，而且多數(shù)為非致病菌，所以長期以來都是生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及工業(yè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，然而面對抗生素“瓶頸時代”的到來，這就需要我們在原有研究基礎(chǔ)上重新開啟抗生素研究的新路徑、新方法、新思維。近年來隨著分子生物學(xué)和基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展以及合成生物學(xué)概念的提出［57］，使人們能夠利用已有的基因組信息和分子生物學(xué)方法明確地對目標(biāo)菌株進(jìn)行改造?；贑RISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，我們可以從兩方面著手，一是可以利用該技術(shù)干擾鏈霉菌中其他代謝旁路來提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量；二是可以利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因敲除或者對鏈霉菌中PKS或NRPS局部替換從而獲得新的代謝產(chǎn)物從而達(dá)到微生物定向育種的目的。本課題組目前正在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對產(chǎn)子囊霉素的吸水鏈霉菌中的PKS或NRPS局部模塊替換，希望得到產(chǎn)他克莫司的突變菌株。CRIPSR除了用于精準(zhǔn)編輯某個基因，還能用于調(diào)控基因的表達(dá)，包括CRISPRi和CRISPR激活（CRISPRa）。cDNA過表達(dá)是上調(diào)個別基因的表達(dá)水平的常用方法，與這種方法相比，CRISPRa使用起來更加簡單，而且可以同時激活多個基因，MIT的CRISPR先驅(qū)張鋒通過改造dCas9和sgRNA優(yōu)化了轉(zhuǎn)錄機(jī)器的招募，成功將RNA表達(dá)水平提升了一個數(shù)量級。鏈霉菌的染色體基因組12%為調(diào)控基因［58］，其中比較典型的包括鏈霉菌抗生素調(diào)節(jié)蛋白（Streptomycesantibiotic regulatory protein，SARP）家族和LuxR家族等，大多數(shù)調(diào)控基因與鏈霉菌的初級及次級代謝有關(guān)，過表達(dá)鏈霉菌中正調(diào)控基因是提高抗生素產(chǎn)量的常用策略，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的簡便性，科學(xué)家們已利用CRISPRa技術(shù)提高細(xì)胞中正調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平，遺憾的是，CRISPRa技術(shù)還未在鏈霉菌中得到應(yīng)用。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷優(yōu)化，相信在不久的將來，通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)在鏈霉菌中獲得新抗生素將會迎來新的契機(jī)。

［1］Lucas X, Senger C, Erxleben A, et al. StreptomeDB：a resource for natural compounds isolated fromStreptomycesspecies［J］. Nucleic Acids Res, 2013, 41（Database issue）：1130-1136.

［2］Campo N, Daveranmingot ML, Leenhouts K, et al.Cre-loxP recombination system for large genome rearrangements inLactococcus lactis［J］. Appl Environ Microbiol, 2002, 68（5）：2359-2367.

［3］Oliynyk M, Stark CB, Bhatt A, et al. Analysis of the biosynthetic gene cluster for the polyether antibiotic monensin inStreptomyces cinnamonensisand evidence for the role ofmonBandmonCgenes in oxidative cyclization［J］. Mol Microbiol, 2003, 5：1179-1190.

［4］Zhou M, Jing X, Xie P, et al. Sequential deletion of all the polyketide synthase and nonribosomal peptide synthetase biosynthetic gene clusters and a 900-kb subtelomeric sequence of the linear chromosome ofStreptomyces coelicolor［J］. FEMS Microbiol Lett,2012, 333（2）：169-179.

［5］Gust B, Challis GL, Fowler K, et al. PCR-TargetedStreptomycesgene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2003, 100（4）：1541-1546.

［6］Sternberg N, Hamilton D. Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between loxP sites［J］. J Mol Biol, 1981, 150（4）：467-486.

［7］Volkert FC, Wilson DW, Broach JR. Deoxyribonucleic acid plasmids in yeasts［J］. Microbiol Rev, 1989, 53（3）：299-317.

［8］Sauer B, Mcdermott J. DNA recombination with a heterospecific Cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of P1-related phages［J］. Nucleic Acids Res, 2004, 20：6086-6095.

［9］Raynal A, Karray F, Tuphile K, et al. Excisable cassettes：New tools for functional analysis ofStreptomycesgenomes［J］. Appl Environ Microbiol, 2006, 72（7）：4839-4844.

［10］Le C, Ran FA, Cox D, et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems［J］. Science, 2013, 6121 ：819-823.

［11］Cheng AW, Wang H, Yang H, et al.Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system［J］. Cell Res, 2013, 23（10）：1163-1171.

［12］Siegl T, Luzhetskyy A. Actinomycetes genome engineering approaches［J］. Antonie Van Leeuwenhoek, 2012, 102（3）：503-516.

［13］Fedoryshyn M, et al.Marker removal from actinomycetes genome using Flp recombinase［J］. Gene, 2008, 419（1-2）：43-47.

［14］Huang H, Zheng G, Jiang W, et al. One-step high-efficiency CRISPR/Cas9-mediated genome editing inStreptomyces［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2015, 47（4）：231-243.

［15］Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing ofStreptomycesspecies using an engineered CRISPR/Cas system［J］. Acs Synthetic Biology, 2015, 4（6）：723-728.

［16］Leskiw BK, et al. The use of a rare codon specifically during development?［J］. Mol Microbiol, 1991, 12 ：2861-2867.

［17］Tong Y, Charusanti P, Zhang L, et al. CRISPR-Cas9 Based engineering of actinomycetal genomes［J］. Acs Synthetic Biology,2015, 4（9）：1020-1029.

［18］Bowater R, Doherty AJ. Making ends meet：repairing breaks in bacterial DNA by non-homologous end-joining［J］. PLoS Genet,2006, 2（2）：e8.

［19］Dubeau MP, Ghinet MG, Jacques PE, et al. Cytosine deaminase as a negative selection marker for gene disruption and replacement in the genusStreptomycesand other actinobacteria［J］. Appl Environ Microbiol, 2009, 75（4）：1211-1214.

［20］Hu Z, Shishi W, Wei X, et al. Highly efficient editing of the actinorhodin polyketide chain length factor gene inStreptomyces coelicolorM145 using CRISPR/Cas9-CodA（sm）combined system［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 24：10575-10585.

［21］雍德祥. 維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及其基因編輯方法［D］. 合肥：安徽大學(xué), 2016.

［22］Shima J, et al.Induction of actinorhodin production by rpsL（encoding ribosomal protein S12）mutations that confer streptomycin resistance inStreptomyceslividansandStreptomyces coelicolor A3（2）［J］. J Bacteriol, 1996, 178（24）：7276-7284.

［23］Qin Z, et al.Formicamycins, antibacterial polyketides produced byStreptomyces formicaeisolated from AfricanTetraponeraplantants［J］. Chem Sci, 2017, 8（4）：3218-3227.

［24］Scherlach K, Hertweck C. Discovery of aspoquinolones A-D,prenylated quinoline-2-one alkaloids fromAspergillus nidulans,motivated by genome mining［J］. Org Biomol Chem, 2006, 4（18）：3517-3520.

［25］Craney A, Ozimok C, et al.Chemical perturbation of secondary metabolism demonstrates important links to primary metabolism［J］. Chem Biol, 2012, 19（8）：1020-1027.

［26］Imai Y, Sato S, et al. Lincomycin at subinhibitory concentrations potentiates secondary metabolite production byStreptomycesspp［J］. Appl Environ Microbiol, 2015, 11：3869-3879.

［27］Onaka H, Mori Y, Igarashi Y, et al.Mycolic acid-containing bacteria induce natural-product biosynthesis inStreptomycesspecies［J］. Appl Environ Microbiol, 2011, 77（2）：400-406.

［28］Moody SC. Microbial co-culture：harnessing intermicrobial signaling for the production of novel antimicrobials［J］. Future Microbiol, 2014, 9（5）：575-578.

［29］Martin R, Sterner O, et al. ChemInform abstract：collinone, a new recombinant angular polyketide antibiotic made by an engineeredStreptomycesstrain［J］. J Antibiotics, 2001, 54（3）：239-249.

［30］Gomezescribano JP, Bibb MJ. EngineeringStreptomyces coelicolorfor heterologous expression of secondary metabolite gene clusters［J］. Microbial Biotechnology, 2011, 4（2）：207-215.

［31］Laureti L, Aigle, Khosla C. Identification of a bioactive 51-membered macrolide complex by activation of a silent polyketide synthase inStreptomycesambofaciens［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108（15）：6258-6263.

［32］Zhou Z, Xu Q, Bu Q, et al. Genome mining-directed activation of a silent angucycline biosynthetic gene cluster inStreptomyces chattanoogensis［J］. Chembiochem, 2015, 16（3）：496-502.

［33］Zhang MM, Wong FT, Wang Y, et al. CRISPR-Cas9 strategy for activation of silentStreptomycesbiosynthetic gene clusters［J］.Nat Chem Biol, 2017. doi：10.1038/nchembio.2341.

［34］Weber, Tilmann, Charusanti, et al. Metabolic engineering of antibiotic factories：new tools for antibiotic production in actinomycetes［J］. Trends Biotechnol, 2015, 33（1）：15-26.

［35］Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, et al.Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities［J］. Nature, 2015, 523（7561）：481-485.

［36］Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, et al. Broadening the targeting range ofStaphylococcus aureusCRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition［J］. Nat Biotechnol, 2015, 33（12）：1293-1298.

［37］Hirano S, Nishimasu H, Ishitani R, et al. Structural basis for the altered PAM specificities of engineered CRISPR-Cas9［J］. Mol Cell, 2016, 61（6）：886-894.

［38］Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, et al.Structure and engineering ofFrancisella novicidaCas9［J］. Cell, 2016, 5：950-961.

［39］Mojica FJ, Díez-Villase?or C, García-Martínez J, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system［J］. Microbiology, 2009, 155（Pt 3）：733-740.

［40］Jinek M, Jiang F, Taylor DW, et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation［J］.Science, 2014, 343（6176）：1247997.

［41］Jiang F, Zhou K, Ma L, et al. STRUCTURAL BIOLOGY. A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition［J］.Science, 2015, 348（6242）：1477-1481.

［42］Anders C, Bargsten K, Jinek M. Structural plasticity of PAM recognition by engineered variants of the RNA-guided endonuclease Cas9［J］. Mol Cell, 2016, 61（6）：895-902.

［43］Horvath P, Romero DA, Coute-Monvoisin AC, et al.Diversity,activity, and evolution of CRISPR loci inStreptococcus thermophilus［J］. J Bacteriol, 2008, 190（4）：1401-1412.

［44］Fonfara I, Le RA, Chylinski K, et al. Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems［J］. Nucleic Acids Res,2014, 42（4）：2577-2590.

［45］Ran FA, et al.In vivogenome editing usingStaphylococcus aureusCas9［J］. Nature, 2015, 520（7546）：186-191.

［46］Nishimasu H, Cong L, Yan WX, et al. Crystal Structure ofStaphylococcus aureusCas9［J］. Cell, 2015, 5：1113-1126.

［47］Zhang Y, Heidrich N, Ampattu BJ, et al. Processing-independent CRISPR RNAs limit natural transformation inNeisseria meningitidis［J］. Mol Cell, 2013, 50（4）：488-503.

［48］Yamada M, et al. Crystal structure of the minimal Cas9 fromCampylobacter jejunireveals the molecular diversity in the CRISPRCas9 systems［J］. Mol Cell, 2017, 65（6）：1109-1121.

［49］Ramalingam S, Annaluru N, Chandrasegaran S. A CRISPR way to engineer the human genome［J］. Genome Biol, 2013, 14（2）：1-4.

［50］Schaefer KA, et al.Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editingin vivo［J］. Nat Methods, 2017, 14（6）：547-548.

［51］Zhu LJ, Lawrence M, Gupta A, et al.GUIDEseq：a bioconductor package to analyze GUIDE-Seq datasets for CRISPR-Cas nucleases［J］. BMC Genomics, 2017, 18（1）：379-388.

［52］Park J, Childs L, Kim D, et al.Digenome-seq web tool for profiling CRISPR specificity［J］. Nat Methods, 2017, 14（6）：548-549.

［53］Wang X, Wang Y, Wu X, et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors［J］. Nat Biotechnol, 2015, 33（2）：175-178.

［54］Nicola C, Abhishek M, Joao SM, et al. Nucleotide-resolution DNA double-strand breaks mapping by next-generation sequencing［J］.Nat Methods, 2013, 10（4）：361-365.

［55］Cameron P, Fuller CK, Donohoue PD, et al. Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage［J］. Nat Methods, 2017, 14（6）：600-606.

［56］Tsai SQ, Nguyen NT, Malagon-Lopez J, et al. CIRCLE-seq：a highly sensitivein vitroscreen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets［J］. Nat Methods, 2017, 14（6）：607-614.

［57］Heinemann M, Panke S. Synthetic biology--putting engineering into biology［J］. Bioinformatics, 2006, 22（22）：2790-2799.

［58］Romero-Rodríguez A, Robledo-Casados I, Sánchez S. An overview on transcriptional regulators inStreptomyces［J］. Biochim Biophys Acta, 2015, 1849（8）：1017-1039.