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    白茅根總黃酮提取工藝及其抗氧化性研究

    2018-06-07 02:47:38李西騰
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年10期
    關(guān)鍵詞:白茅根光度黃酮

    翁 梁, 李西騰

    (江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品學(xué)院,江蘇淮安 223003)

    白茅根為禾本科植物白茅[ImperatecylindriaBeauv. var.major(Nees) C. E. Hubb.]的根莖,又稱白花茅根、茅草根、甜草根等[1],是我國傳統(tǒng)的中藥材。白茅根性甘、味寒,有涼血止血、清熱利尿之功效,臨床可用于治療熱病煩渴、血淋、水腫、黃疸等癥[2-3]。近幾年的研究顯示,白茅根的主要化學(xué)成分有三萜類化合物、有機(jī)酸、多糖、黃酮類物質(zhì)等[4]。藥理研究的結(jié)果表明,白茅根具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血脂等作用[5]。

    目前,國內(nèi)對白茅根活性成分提取工藝的研究多集中在多糖的提取,并做了大量系統(tǒng)的研究[6]。還有科技工作者對白茅根的綠原酸、總酚酸和總?cè)莆镔|(zhì)的提取進(jìn)行了研究[7-8],但有關(guān)白茅根中總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性的研究尚未見報(bào)道。因此,本試驗(yàn)采用乙醇溶液作為浸提劑,用水浴浸提法提取白茅根中的總黃酮,并對白茅根總黃酮體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    白茅根,購自安徽省亳州市志民藥業(yè)有限公司。蘆丁,購自上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司。無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、維生素C等均為分析純,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為食品級,均購自江蘇省淮安國藥化學(xué)試劑有限公司。

    粉碎機(jī),購自上海隆拓儀器設(shè)備有限公司;UV765-可見分光光度計(jì),購自上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子精密天平,購自奧豪斯儀器(上海)有限公司;恒溫水浴鍋,購自上海喬躍電子有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[9]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取5 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于20 mL容量瓶中,用60%乙醇溶液溶解并定容,分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL 置于10 mL比色管中,加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液,放置6 min,再加入0.3 mL 10%硝酸鋁鈉溶液,放置 6 min 后加入4.0 mL 5%氫氧化鈉溶液,加水至刻度線,搖勻,放置15 min,在510 nm處測吸光度,以蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(D)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程D=0.309 6C+0.005 8,r2=0.999 1,表明在0~0.12 mg/mL范圍內(nèi),蕓香苷濃度與吸光度具有線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

    1.2.2 白茅根總黃酮提取方法 將白茅根于60 ℃烘干,粉碎過60目篩。準(zhǔn)確稱取1.0 g粉末樣品,加入乙醇溶液,置于水浴鍋中提取,提取3次,合并提取液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法顯色后,在510 nm波長處測量樣品溶液的吸光度。

    白茅根總黃酮含量的計(jì)算公式:總黃酮含量=C×N×V/M。其中,C為樣品的吸光度代入回歸方程計(jì)算得到的總黃酮濃度,mg/mL;N為樣品稀釋倍數(shù);V為加入乙醇提取液的體積,mL;M為粉末樣品質(zhì)量,g。

    1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用水浴法,用乙醇溶液作為浸提劑,按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取溫度 60 ℃、提取時(shí)間60 min的基本提取工藝,以總黃酮提取量為指標(biāo),確定其他條件不變,改變單因素的值,分別考察料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g ∶mL)]、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對白茅根總黃酮提取量的影響。

    1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間等4個(gè)因素,采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),通過對白茅根總黃酮提取量和正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,確定最佳提取工藝。

    1.2.5 抗氧化活性研究

    1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測定 將白茅根總黃酮提取液、BHT、維生素C配制成不同濃度的待測樣品液,再與0.01 mmol/L DPPH溶液混勻,室溫下反應(yīng)30 min,然后在 517 nm 波長處測定其吸光度[9]。

    DPPH自由基清除率計(jì)算公式:清除率=(1-D/D0)×100%。式中,D為樣品溶液的吸光度,D0為用無水乙醇代替樣品溶液作為空白對照的吸光度。

    1.2.5.2 白茅根總黃酮還原能力測定 采用普魯士蘭法[10]測定白茅根總黃酮的還原力,以普魯士蘭的生成量為指標(biāo),在700 nm波長處測定其吸光度。試驗(yàn)用相同濃度的BHT、維生素C作為對照品,吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 料液比對白茅根總黃酮提取量的影響 按乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min,考察當(dāng)料液比分別為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g ∶mL)時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖2可知,隨著料液比的變化,白茅根總黃酮提取量先升后降。當(dāng)料液比為1 g ∶40 mL時(shí),總黃酮提取量最高,達(dá)到1.622 mg/g。隨后當(dāng)料液比為1 g ∶50 mL時(shí),總黃酮提取量下降。

    2.1.2 乙醇濃度對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min,考察當(dāng)乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖3可知,隨著乙醇濃度逐漸增大,白茅根總黃酮的提取量也逐漸增加,當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)提取量達(dá)到最大值,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí),總黃酮的提取量明顯下降。

    2.1.3 提取溫度對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取時(shí)間60 min,考察當(dāng)提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖4可知,隨著提取溫度的升高,總黃酮提取量逐漸增加。當(dāng)提取溫度達(dá)到60 ℃及以上時(shí),總黃酮提取量增加的較少且趨于平穩(wěn)。

    2.1.4 提取時(shí)間對白茅根總黃酮提取量的影響 按料液比1 g ∶30 mL、乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃,考察當(dāng)提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min時(shí)對白茅根總黃酮提取量的影響。由圖5可知,提取時(shí)間在30~90 min內(nèi),白茅根總黃酮提取量增加的較為明顯。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到90 min及以后時(shí),總黃酮提取量趨于穩(wěn)定,增加量較小。

    2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    由表1可知,正交試驗(yàn)的極差(R)表現(xiàn)為A>D>C>B,說明對白茅根總黃酮提取量的影響表現(xiàn)為料液比>提取時(shí)間>提取溫度>乙醇濃度。白茅根總黃酮最佳提取工藝組合為A2B3C3D3,即料液比為1 g ∶40 mL、乙醇濃度為80%、提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為150 min。根據(jù)表2方差分析的結(jié)果可知,料液比、提取時(shí)間、提取溫度對總黃酮提取量具有顯著影響(P<0.05)。

    2.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.1 DPPH自由基清除率測定結(jié)果 由圖6可知,白茅根總黃酮對DPPH自由基有明顯的清除作用。在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi),白茅根總黃酮對DPPH自由基清除作用隨著濃度的升高逐步增強(qiáng),當(dāng)濃度為1.50 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到45.17%。但白茅根總黃酮對DPPH自由基的清除率明顯低于相同濃度的維生素C,略好于相同濃度的BHT,說明白茅根總黃酮具有較好的抗氧化作用。

    表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

    表2 方差分析結(jié)果

    注:“*”表示在0.05水平上影響顯著。

    2.3.2 白茅根總黃酮還原能力測定結(jié)果 吸光度的變化反映樣品還原能力的強(qiáng)弱,吸光度越大,樣品的還原能力越強(qiáng),還原能力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng)。由圖7可知,在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi),白茅根總黃酮的還原能力隨著濃度的升高逐步增強(qiáng),且還原力與濃度有線性關(guān)系。與相同濃度的維生素C相比,白茅根總黃酮的還原力明顯較差,但好于相同質(zhì)量濃度的BHT,說明白茅根總黃酮具有較好的抗氧化性。

    3 結(jié)論與討論

    試驗(yàn)以乙醇溶液作為浸提劑,用水浴浸提法提取白茅根總黃酮,采用分光光度法測定總黃酮含量。結(jié)果表明,最佳提取工藝條件為料液比1 g ∶40 mL、乙醇濃度80%、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間150 min。該提取工藝穩(wěn)定可靠,如若結(jié)合其他提取技術(shù),能否進(jìn)一步提高總黃酮的提取量,還須再做深入研究。

    試驗(yàn)測定白茅根總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力及還原能力,并以相同濃度的BHT、維生素C作對照。結(jié)果表明,白茅根總黃酮清除DPPH自由基的能力及還原能力明顯小于相同濃度的維生素C,略高于相同濃度的BHT。說明白茅根總黃酮具有一定的抗氧化作用,但其抗氧化的具體成分還須做進(jìn)一步研究。

    參考文獻(xiàn):

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