黃血高度油蠶全蠶粉對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

何行健 艾均文 薛 宏 鄭 穎 劉 勇 唐 蕓 劉 洋 汪維熙 朱 賢 葉征明

(湖南省蠶桑科學(xué)研究所， 湖南長沙 410127)

家蠶幼蟲在降血糖方面的利用是家蠶多功能利用中較為突出的方向。自研究人員發(fā)現(xiàn)全蠶粉的降血糖作用后[1]，在包括韓國在內(nèi)的亞洲國家中，由家蠶5齡幼蟲制備的全蠶粉長期以來受到糖尿病患者的青睞。研究表明，1-脫氧野尻霉素(DNJ)作為一種潛在的降糖成分，在全蠶粉中的含量約為在干桑葉粉中含量的2.7倍[2]。以全蠶粉為原料研制的降血糖產(chǎn)品，作為保健食品在韓國已通過食品和藥物管理局認(rèn)定，自1995年以來已生產(chǎn)約3 000 t[3]。日本甚至有望將全蠶粉作為治療II型糖尿病的替代藥物來使用[4]。我國也從2000年開始關(guān)注全蠶粉[5]，普遍認(rèn)為，全蠶粉在中國開發(fā)應(yīng)用的前景十分廣闊。

有研究發(fā)現(xiàn)，普通家蠶幼蟲體壁含有大量的尿酸鹽結(jié)晶[6]，有誘發(fā)痛風(fēng)的可能，不太適宜于直接制備全蠶粉。而馬寶俊等[7]、杜鑫等[8]、王安皆等[9]研究發(fā)現(xiàn)，油蠶體壁中尿酸鹽富集程度明顯低于普通蠶，更適合作為藥食用的原料，但到目前為止，對(duì)于這類特殊資源的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)方面的研究還很少。本研究對(duì)以黃血高度油蠶5齡第3天幼蟲為原料制備的全蠶粉進(jìn)行急性經(jīng)口毒性檢測(cè)，以期為黃血高度油蠶全蠶粉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用全蠶粉 黃血高度油蠶全蠶粉，黃血高度油蠶[10]5齡第3天幼蟲經(jīng)真空冷凍干燥后制備而成，200目左右，湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所生產(chǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，許可證編號(hào)SCXK(滬)2012—0002，健康、初成年、未使用過，雌性動(dòng)物未產(chǎn)且無孕，試驗(yàn)開始體質(zhì)量為12～22 g/只，同性別試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間體質(zhì)量相差不超過平均體質(zhì)量的20%，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；玉米芯墊料及輻照滅菌飼料，蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)器具的處理 將黃血高度油蠶全蠶粉接觸的所有器具均置于壓力蒸汽滅菌器內(nèi)115 ℃，30 min滅菌后使用。

1.2.2 ICR小鼠的飼養(yǎng) 使用蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司生產(chǎn)的玉米芯墊料及輻照滅菌飼料，飲用滅菌水，在室溫20～26 ℃、相對(duì)濕度30%～70%、全光譜日光燈每天進(jìn)行12 h光照條件下飼養(yǎng)。

1.2.3 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 參考急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法[11]進(jìn)行：取20只ICR小鼠，雌雄各半，分組，染色標(biāo)記，試驗(yàn)前，禁食過夜，不限制飲水。采用最大耐受劑量法，根據(jù)全蠶粉有關(guān)資料，全蠶粉為顯示毒性極小或未顯示毒性的受試物，確定全蠶粉濃度為250 mg/mL[以毒性極小或未顯示毒性的受試物的最大耐受劑量為10 000 mg/kg來設(shè)定，即供試樣品濃度=最大耐受劑量(10 000 mg/kg)/(20 mL/kg×2)=250 mg/mL]作為試驗(yàn)樣品的供試濃度，1日內(nèi)2次(間隔4～6 h)通過灌胃方式給予濃度為250 mg/mL的試驗(yàn)樣品混懸液20 mL/kg(小鼠最大灌胃劑量)進(jìn)行試驗(yàn)。灌胃后繼續(xù)禁食1～2 h。灌胃完畢后的30 min內(nèi)，觀察小鼠即時(shí)反應(yīng)，再觀察24 h內(nèi)小鼠的毒性反應(yīng)，以后每天觀察和記錄每只小鼠的一般狀態(tài)，毒性表現(xiàn)，毒性反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)時(shí)間，動(dòng)物死亡時(shí)間及死亡數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行大體解剖觀察，記錄大體病變，灌胃后超過24 h死亡的動(dòng)物，若發(fā)現(xiàn)臟器病變則進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，供試的20只小鼠在7 d觀察期內(nèi)未出現(xiàn)死亡，也未出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)及軀體運(yùn)動(dòng)等方面的任何異常癥狀，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行大體解剖觀察，未見主要臟器組織(如脾臟、肝臟、腎臟、心臟、胸腺等)發(fā)生病變。從以黃血高度油蠶為原料制備的全蠶粉對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性(表1)可以看出，在本試驗(yàn)條件下，以黃血高度油蠶為原料制備的全蠶粉對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性最大耐受劑量大于10 000 mg/kg，在灌胃劑量為20 mL/kg·次下，供試小鼠無明顯不良癥狀，按急性毒性分級(jí)屬實(shí)際無毒。

表1以黃血高度油蠶為原料制備的全蠶粉對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性

試驗(yàn)動(dòng)物灌胃劑量/(mL/kg·次)數(shù)量/只初質(zhì)量/(g/只)終質(zhì)量/(g/只)死亡數(shù)/只器臟病變數(shù)/只雌性ICR小鼠201022.1±0.726.3±0.400雄性ICR小鼠201021.8±0.525.5±0.900

表中的初質(zhì)量、終質(zhì)量為10只ICR小鼠的平均值；用于灌胃的黃血高度油蠶全蠶粉的濃度為250 mg/mL。

3 小結(jié)與討論

全蠶粉因降血糖作用顯著且無明顯的毒副作用而具有廣闊的開發(fā)前景，長期以來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究人員對(duì)全蠶粉及原材料的組成成分、功效成分、生理活性進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。KIM[12]報(bào)道，全蠶粉主要含54.8%的粗蛋白、9.4%的粗脂肪、7.2%的粗纖維、7.7%的灰分和10.6%的水分；金潔等[13]研究發(fā)現(xiàn)，家蠶幼蟲富含具有抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝等作用的黃酮類化合物，最高可達(dá)11.107～27.705 mg/g；桂仲爭等[14]檢測(cè)結(jié)果表明，全蠶粉中含有對(duì)胰島素水平及其受體可能起一定作用的活性物質(zhì)三碘甲腺原氨酸(T3)，含量約為0.913 ng/g。對(duì)家蠶藥食用安全性方面的研究也有不少，端禮榮等[15]為驗(yàn)證家蠶作為生物反應(yīng)器對(duì)人體的安全性，對(duì)家蠶幼蟲和蛹的體液、蠶卵等進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，所有受試物的急性毒性均為無毒級(jí)；岳萬福[16]在家蠶體內(nèi)表達(dá)SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)基因后，以獲得的可表達(dá)SOD的家蠶為材料通過低溫冷凍真空干燥制備成SOD全蠶粉，并對(duì)制成的SOD全蠶粉進(jìn)行了急性毒性檢驗(yàn)和長期毒性檢驗(yàn)，以明確SOD全蠶粉在使用中的安全性，SOD全蠶粉急性毒性檢驗(yàn)結(jié)果表明，SOD全蠶粉在灌胃最大限度時(shí)，無動(dòng)物死亡，最大耐受劑量下也未見明顯毒副反應(yīng)，長期毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，SOD全蠶粉對(duì)小鼠的健康沒有明顯不良影響。

相對(duì)于普通家蠶，黃血高度油蠶具有黃血和高度油蠶2種特殊性狀。在家蠶中，白血是正常血型，黃血作為一種突變血型，反映在蠶體形態(tài)上，有幼蟲腹足和羽化初期蛾翅為黃色等特點(diǎn)[17]，據(jù)陳智毅等[18]、肖陽等[19]對(duì)黃血蠶的營養(yǎng)成分和藥食用價(jià)值的研究表明，黃血蠶含有大量的蛋白質(zhì)、豐富的微量元素、高比例的不飽和脂肪酸和較高含量的黃酮類化合物等，具有比普通家蠶更高的營養(yǎng)價(jià)值。另外，油蠶也是一種突變型，油蠶體壁的透明程度由體壁真皮細(xì)胞中尿酸鹽結(jié)晶的含量決定，高度油蠶的體壁真皮細(xì)胞中尿酸鹽結(jié)晶的含量最低[6]。由于尿酸鹽結(jié)晶可以直接被機(jī)體吸收而有誘發(fā)痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)[20]，因此尿酸鹽含量較低的高度油蠶更適于藥食品的開發(fā)利用。目前，聚合了這2種突變性狀的黃血高度油蠶尚未發(fā)現(xiàn)有藥食用相關(guān)的研究。本研究結(jié)果顯示，由黃血高度油蠶5齡第3天幼蟲所制備的全蠶粉在1日內(nèi)2次，20 mL/kg·次的小鼠最大灌胃劑量(最大耐受劑量10 000 mg/kg)下，未見小鼠出現(xiàn)異常和死亡。根據(jù)急性毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為由黃血高度油蠶所制備的全蠶粉為無毒級(jí)。該試驗(yàn)系統(tǒng)由小鼠來檢測(cè)接觸此類全蠶粉的急性經(jīng)口毒性反應(yīng)，為黃血高度油蠶全蠶粉在人類中的推廣和應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

[1] JEONG S H，KIM M S，RYU G S.Effect of silkworm extract on intestinal α-glycosidase activity in mice administered with a high carbohydrate-containing diet[J].Korean J Seric Sci，1997，39(1)：86-92.

[2] ASANO N，YAMASHITA T，YASUDA K，et al.Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees (MorusalbaL.) and silkworms (BombyxmoriL.)[J].J Agric Food Chem，2001，49(9)：4 208-4 213.

[3] 柳江善，李羲三，金基永，等.韓國對(duì)家蠶及其產(chǎn)品的功能性研究進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué)，2012，38(4)：749-757.

[4] YATSUNAMI K，MURATA K，KAMEI T.1-Deoxynojirimycin content and alfa-glucosidase inhibitory activity and heat stability of 1-deoxynojirimycin in silkworm powder[J].Food Nutr Sci，2011，2(2)：87-89.

[5] 桂仲爭，莊大桓.全蠶粉及其生理功能[J].中國蠶業(yè)，2000，21(2)：53-54.

[6] 畑村又好.油蠶性與尿酸的關(guān)系[J].蠶絲試驗(yàn)場(chǎng)報(bào)告，1943，11(3)：347-357.

[7] 馬寶俊，高玉軍.特殊用途家蠶品種介紹[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，22(1)：70-71.

[8] 杜鑫，費(fèi)建明，李軍，等.蠶品種選育多用途化發(fā)展趨勢(shì)[J].蠶桑通報(bào)，2007，38(1)：11-14.

[9] 王安皆，婁齊年，周麗霞，等.油蠶的生理特征及其開發(fā)利用[J].北方蠶業(yè)，2009，30(2)：9-10.

[10] 何行健，薛宏，劉昌文，等.全蠶粉用黃血高度油蠶品種的選育初報(bào)[J].中國蠶業(yè)，2016，37(2)：47-51.

[11] 國家技術(shù)監(jiān)督局.食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序：GB 15193.3—2003[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：19-88.

[12] KIM Y H.Effect of bread with added silkworm powder and cholesterol on lipid metabolism of rat[J].Korean J Food Nutr，2008，21(3)：306-311.

[13] 金潔，劉淑梅，時(shí)連根.家蠶幼蟲體中黃酮類化合物含量的變化規(guī)律[J].蠶業(yè)科學(xué)，2005，31(2)：141-144.

[14] 桂仲爭，陳杰，陳偉華，等.全蠶粉(SP)降血糖的作用效果及其機(jī)理的研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2001，27(2)：114-118.

[15] 端禮榮，何家祿，陸榮柱，等.家蠶制品的急性毒性及微核試驗(yàn)[J].毒理學(xué)雜志，2000，14(1)：55.

[16] 岳萬福.基于家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2009.

[17] 代方銀，魯成，張健飛.家蠶蛾黃翅的遺傳分析與黃血基因的多效作用[J].蠶學(xué)通訊，2000，20(1)：1-4.

[18] 陳智毅，廖森泰，李清兵，等.多化性黃血蠶的食用和藥用價(jià)值的研究[J].蠶業(yè)科學(xué)，2002，28(2)：173-176.

[19] 肖陽，吳福泉，王振江，等.蠶體黃酮類化合物的提取及不同家蠶品種間的含量差異[J].蠶業(yè)科學(xué)，2011，37(2)：358-361.

[20] 董鵬，宋慧.痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，35(12)：1 695-1 699.