葛根素與人血漿蛋白結(jié)合率研究

劉夏雯

（廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東 廣州 511436）

1.前言

葛根素在臨床上常用于高血壓、冠心病和心血管疾病的治療。目前對這類異黃酮化合物的臨床新應(yīng)用及新機(jī)制探討是研究熱點(diǎn)[1，2]。然而，這類化合物的生物利用度很低。已發(fā)現(xiàn)造成低生物利用度的原因包括首過代謝和吸收[3]。然而藥物被吸收后，進(jìn)入血液循環(huán)，其中一部分與血漿蛋白結(jié)合，另一部分以游離態(tài)通過毛細(xì)血管壁到達(dá)各個靶點(diǎn)，發(fā)揮藥效。當(dāng)游離態(tài)藥物分布至組織或被代謝清除后，部分結(jié)合藥物又從血漿蛋白重新游離出來。藥物與血漿蛋白的可逆性結(jié)合對藥物的生物利用度發(fā)揮了巨大的影響。然而葛根素與血漿蛋白結(jié)合率研究尚未報(bào)道。

因此，本研究對葛根素與人血漿蛋白結(jié)合進(jìn)行研究。利用平衡透析法對葛根素及人血漿以及人血清白蛋白（HSA）和α1-酸性糖蛋白（AGP）分別進(jìn)行共孵育。利用液質(zhì)聯(lián)用法對透析膜兩測的葛根素進(jìn)行分析。研究葛根素的血漿蛋白結(jié)合率，并闡明主要結(jié)合的蛋白類型。為理解葛根素的低生物利用度提供依據(jù)。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與試劑

葛根素和鳶尾苷對照品購自美國Sigma公司。人血漿來自于本實(shí)驗(yàn)室志愿者。人血清白蛋白和人酸性糖蛋白購于美國Sigma公司。PBS(0.1M，pH 7.4)購自美國GIBCO公司。色譜級甲醇和乙腈購于美國Fisher。其它試劑為化學(xué)純。RED快速平衡透析裝置購于美國Thermo。液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)為Agilent1260-6460三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 RED裝置預(yù)處理 本試驗(yàn)所采用的快速平衡透析裝置由便攜式的插入管和48孔PTFE基質(zhì)的底板組成。使用前，底板在20%乙醇溶液中浸泡10min，然后用去離子水沖洗3次后，室溫晾干。透析室在去離子水中浸泡10min，重復(fù)兩次后，在保持膜濕潤的條件下立即使用。

2.2.2 樣品預(yù)處理 內(nèi)標(biāo)儲備液10μL 20μg/mL置于2mL離心管中，N2吹干后，加入樣品100μL，后加入300μL 甲醇，渦旋混合5分鐘，13，000×g離心5分鐘，取上清，N2吹干，殘?jiān)?00μL流動相復(fù)溶，2μL進(jìn)樣。

2.2.3 RRLC-MS/MS方法及方法驗(yàn)證

LC-MS/MS方法

分析柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8μm，2.1×50mm）；流動相為0.01% 冰醋酸溶液：甲醇=20%∶80%，流速0.3mL/min。質(zhì)譜為ESI離子源，正模式。血漿中葛根素含量通過多反應(yīng)檢測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式進(jìn)行測定。葛根素選擇離子對為m/z 417/399，內(nèi)標(biāo)鳶尾苷離子對為m/z 463/301。

方法驗(yàn)證

方法驗(yàn)證參考中國藥典9012指導(dǎo)原則。主要驗(yàn)證參數(shù)為：專屬性，回收率，線性，準(zhǔn)確度，精密度，攜帶效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)及穩(wěn)定性。

2.2.4 藥物與蛋白結(jié)合數(shù)學(xué)模型及數(shù)據(jù)處理 利用Scatchard方程，以指結(jié)合藥物濃度CB為X軸，結(jié)合和游離藥物濃度比值CB/CU為Y軸，由非線性最小二乘法估計(jì)得出Y軸上的截距，即nKa，從而得到藥物的結(jié)合常數(shù)。藥物與蛋白結(jié)合率按B=(1-CU/CB)×100%計(jì)算；

2.2.5 葛根素與人血漿蛋白，HAS和AGP結(jié)合反應(yīng) 分別配制HAS和AGP于PBS至終濃度為40mg/mL和1mg/mL，取空白人血漿，加入葛根素使其終濃度為0.2、1、5、10、15mM。取200μL含藥血漿加入樣品室，取350μL PBS加入緩沖液室，于37℃孵育4h。樣品室和緩沖液室分別吸取100μL和250μL，按照“樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法操作，由LC-MS檢測血漿樣品藥物總濃度(CB)，緩沖液樣品Z中游離藥物濃度(CU)。

葛根素與人血漿蛋白，HAS和AGP在考察濃度范圍內(nèi)（0.2～15μM）結(jié)合率分別高于99%，99%和97%。在低濃度范圍呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著藥物濃度的增大，結(jié)合率升高，當(dāng)濃度達(dá)到1～5μM后，結(jié)合率趨于飽和（見圖1）。

圖1 人血漿白蛋白和酸性糖蛋白中游離葛根素比例。數(shù)據(jù)表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3。

葛根素與HAS和AGP結(jié)合的擬合曲線說明游離藥物濃度和結(jié)合藥物數(shù)值都有良好的相關(guān)性，r2(+)=0.9799，r2(-)=0.9847，提示了葛根素與HAS和AGP的結(jié)合類型可能均屬于一類位點(diǎn)的不飽和結(jié)合。結(jié)合常數(shù)分別為3.5×107M-1和1.5×107M-1。

3.討論

結(jié)果表明高血漿蛋白結(jié)合率限制了葛根素進(jìn)入靶組織，造成其低生物利用度。另外，葛根素與AGP和HSA都高度結(jié)合，提示了葛根素與人血漿的高結(jié)合率來源于與HSA和AGP的共同作用。

[1]張玲，王洪新，齊志敏，孫媛.葛根素對大鼠心肌肥厚的相關(guān)細(xì)胞因子的影響[J].中成藥，2007，29(7):960-963.

[2] Chengfeng Luo,Mu Yuan,Minsheng Chen.Metabolites of puerarin identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry：Similar metabolic profiles in liver and intestine of rats.Jounarl of Chromatography B,2010, 878,363-370.