TTC法測定金蕎麥種子生活力條件的優(yōu)化

檀龍顏 吳依琳 馬洪娜

【摘 要】 目的：獲得氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定金蕎麥種子生活力的最佳條件。方法：以染色濃度、染色時間和染色溫度為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)、Central Composite Design響應(yīng)面分析3種方式進(jìn)行篩選和優(yōu)化。結(jié)果：TTC濃度0.5 %、染色溫度40℃、染色時間4h為最佳測定條件。結(jié)論：用正交試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面分析對TTC法測定金蕎麥種子生活力的條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化是可行的。

【關(guān)鍵詞】 金蕎麥;種子生活力;TTC法;正交試驗(yàn);單因素試驗(yàn);響應(yīng)面分析

【中圖分類號】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）1-0026-05

Optimization of Seed Vigor Test Conditions by TTC Method in Fagopyrum dibotry

TAN Longyan WU Yilin MA Hongna

School of Pharmaceutical Sciences， Guizhou University of Traditional Chinese medicine， Guiyang 550025， China

Abstract：Objective To obtain the best conditions for determination of seed viability of Fagopyrum dibotry by 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride （TTC） method. Methods The samples with dyeing concentration， dyeing time and dyeing temperature as indexes， and orthogonal test， single factor test and Central Composite Design response surface analysis were used to select and optimize. Results TTC concentration 0.5%， dyeing temperature 40 ℃ and dyeing time 4 h were the best conditions. Conclusion It is feasible to select and optimize the conditions of TTC method to determine Fagopyrum dibotry seed viability by orthogonal test， single factor test and response surface analysis.

Keywords：Fagopyrum Dibotry; Seed Viability; TTC Method; Orthogonal Test; Single Factor Test; Central Composite Design Response Surface Analysis

金蕎麥（Fagopyrum dibotry）為蓼科蕎麥屬（Fagopyrum）多年生草本植物，以干燥根莖入藥[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)[3]研究表明金蕎麥根據(jù)具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和增強(qiáng)免疫力的作用，在臨床上能夠治療呼吸系統(tǒng)疾病、腸道系統(tǒng)疾病和腫瘤等。同時，金蕎麥種子中富含蛋白質(zhì)、脂類和維生素等，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用[4]。此外，金蕎麥莖葉為牛羊等牲畜喜食，是一種優(yōu)良牧草[5]。因此，金蕎麥為一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的資源植物。種子是種子植物的繁殖體，也是植被恢復(fù)和重建的物質(zhì)基礎(chǔ)，而種子的生活力檢測是預(yù)判種子是否具有繁殖價(jià)值的重要手段[6]。本研究采用正交試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)和Central Composite Design 響應(yīng)面試驗(yàn)對 TTC 法測定金蕎麥種子生活力的條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以期種子為生物學(xué)研究和規(guī)模化生產(chǎn)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料 金蕎麥種子采自貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院種植資源圃，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院檀龍顏副教授鑒定為金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）種子，采種后陰干，于4℃保存?zhèn)溆?。測定試劑為氯化三苯基四氮唑（TTC） 。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 種子浸泡：將去除雜質(zhì)，種皮無破損的金蕎麥種子置于燒杯中浸泡24h后，從種子中間切斷，將胚切面較完整的每50個半粒種子置于直徑9cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。種子染色：方法同馬洪娜等[6]。

1.2.2 正交試驗(yàn) 選取TTC濃度（A） （0.3%、0.5%、0.7%）、染色溫度（B）（35℃、40℃、45℃）、染色時間（C）（2h、3h、4h）3個因素的不同水平，每組50個半粒種子，通過正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.2.3 單因素試驗(yàn) ①染色時間試驗(yàn)：取50個金蕎麥半粒種子，TTC濃度設(shè)置為0.5%，溫度設(shè)置為40℃，時間設(shè)置1h、2h、3h、4h、5h和5個水平;②染色溫度試驗(yàn)：取50個金蕎麥半粒種子，TTC濃度設(shè)置為0.5%，時間設(shè)置為4h，溫度設(shè)置30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等5個水平;③染色TTC濃度試驗(yàn)：取50個金蕎麥半粒種子，溫度設(shè)置為40℃，時間設(shè)置為4h，TTC濃度設(shè)置為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%等5個水平。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 以TTC濃度（A）、染色溫度（B）、染色時間（C）為變量，依據(jù)Central Composite Design設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素5水平試驗(yàn)。每個處理50個金蕎麥半粒種子。以種子生活力為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 種子生活力根據(jù)染色顏色的深淺和比率計(jì)算，利用SPSS17.0軟件和Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，組合為TTC濃度0.3%，染色溫度35℃，染色時間2h的金蕎麥種子生活力最低（59.3%）， 組合染色溫度40℃，TTC濃度0.5%，染色時間3h種子生活力最高（85.2%）。方差分析結(jié)果顯示，因素TTC染色濃度差異顯著，染色溫度和染色時間均差異不顯著（表2）。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果 從表3可以看出，隨著染色時間增加，顏色由黃色到粉色再到深紅色，1～ 4h種子生活力逐漸增加，5h時種子生活力顯著降低，種子活力最高為染色4h。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗(yàn)法的最佳染色時間選擇為4h。

當(dāng)TTC濃度從0.1 % ～ 0.5 %時，金蕎麥種子的生活力逐漸增大，染色顏色由淺粉色到粉色、紅色，其中TTC濃度為0.5%時最大。當(dāng)TTC濃度為0.7%時和0.9%時，染色顏色為深紅色，但種子的活力下降下降。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗(yàn)法的最佳TTC濃度為0.5%（表 4）。

染色溫度為30℃ ～ 40℃之間的金蕎麥種子，種子生活力逐漸增大，胚顏色由淺粉色到淺紅色和紅色。當(dāng)溫度超過40℃時，種子生活力反而隨著溫度的升高而降低，胚顏色也從黃白色至白色，說明種子并沒有被TTC染色。因此，金蕎麥種子生活力TTC單因素試驗(yàn)法最佳溫度為40℃（表 5）。

基于以上的3個單因素試驗(yàn)結(jié)果，金蕎麥種子生活力TTC測定法的單因素試驗(yàn)中，TTC濃度（0.5%）×染色溫度（40℃）×染色時間（4h）為最佳條件，該結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相近。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 模型的建立與分析 根據(jù)Central Composite Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表6，將表6結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，分析結(jié)果見表7?；貧w分析得回歸方程：Y=+86.79+0.35A-3.04B+1.96C-6.96AB-0.46AC-3.39BC-10.36A2-5.64B2-2.44C2。模型的F值為16.37，且P<0.0001，表明模型差異極顯著。校正決定系數(shù)R2adj=0.9848，相關(guān)系數(shù)R2=0.9424，表明該模型的擬合度較好，可用于種子生活力的理論預(yù)測。模型的變異系數(shù)為5.45%（<10%），表明模型穩(wěn)定性良好，試驗(yàn)操作可靠。模型的信噪比為10.315（>4），表明該模型能真實(shí)地反映試驗(yàn)結(jié)果。

模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，3個因素對金蕎麥種子生活力測定影響差異極顯著，且各因素的影響順序?yàn)槿旧珳囟?染色時間>TTC濃度。

2.3.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面試驗(yàn)法中，響應(yīng)面圖曲面坡度的陡峭程度，能直觀體現(xiàn)各兩個因素的交互作用對種子生活力響應(yīng)值的影響。其中，染色溫度與TTC濃度的交互作用對響應(yīng)值影響最大（圖1），響應(yīng)面的傾斜度最高，其次是TTC濃度與染色時間（圖2），最后是染色溫度與染色時間（圖3）。通過響應(yīng)面法優(yōu)化，試驗(yàn)組TTC濃度（0.5%）×染色溫度（40℃）×染色時間（4 h）是金蕎麥種子生活力TTC法測定的最佳條件，此組合下，理論種子生活力為87.8%。在此條件下，進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，實(shí)測生活力為86.72%、86.93%、86.7%，平均生活力為86.78%。試驗(yàn)生活力測定值與理論預(yù)測值的誤差為1.02%（<5%），因此，應(yīng)用Design-Expert中的Central Composite Design響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化金蕎麥種子TTC法測定條件是可行的。

3 討論

3.1 利用響應(yīng)面優(yōu)化能得到較為精確的試驗(yàn)參數(shù) 盡管正交試驗(yàn)?zāi)軌驕p少工作量，且具有高效、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，但是正交試驗(yàn)的優(yōu)選結(jié)果不會超越所取水平的范圍，不是很精確。單因素講究效率，但是篩選的參數(shù)范圍不是很精確。因此，無論是單因素試驗(yàn)還是正交試驗(yàn)都有一定的缺限。而本試驗(yàn)種響應(yīng)面分析優(yōu)化金蕎麥種子生活力測定的最佳條件為TTC濃度（0.5 %）×染色溫度（40℃）× 染色時間（4h），與正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的結(jié)果相近或一致。表明單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)合，同時利用響應(yīng)面法優(yōu)化，則能得到較為可靠的試驗(yàn)參數(shù)。

3.2 響應(yīng)面分析法能在更廣闊的領(lǐng)域應(yīng)用 響應(yīng)面分析法利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題，一般在工程類工藝設(shè)計(jì)中應(yīng)用較為廣泛。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，頭花蓼種子[7]和羊耳菊種子[8]，以及山豆根種子[6， 9]生活力測定中，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化相應(yīng)測定條件已獲得了較好的結(jié)論，且本文結(jié)果也表明利用響應(yīng)面分析優(yōu)化金蕎麥種子生活力測定條件是可行的。因此，響應(yīng)面分析法的應(yīng)用面較廣，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用。

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（收稿日期：2020-07-03 編輯：陶希睿）