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    膜聯(lián)蛋白A1基因的表達(dá)與膽囊癌臨床病理的關(guān)系及調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3信號(hào)通路對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

    2018-06-07 03:04:56江若霞趙麗敏
    安徽醫(yī)藥 2018年6期
    關(guān)鍵詞:檢測

    江若霞 ,趙麗敏

    (1.河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校醫(yī)學(xué)系,河南 鄭州 451191;2.河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院病理科,河南 鄭州 450004)

    膽囊癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病的機(jī)制及病因復(fù)雜,診斷困難,但大部分患者在確診時(shí)已處于晚期,手術(shù)的切除率很低[1]。因此,尋找診斷和預(yù)防的方法進(jìn)行早期治療具有重要意義。膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1,ANXA1)是鈣離子依賴磷脂蛋白結(jié)合家族中的一員,其具有參與調(diào)控炎性反應(yīng)、凝血過程、鈣離子通道的形成、細(xì)胞的凋亡和分化等多種生物學(xué)功能[2-4]。研究顯示,ANXA1在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等腫瘤中表達(dá)增強(qiáng),而在前列腺癌、宮頸癌等腫瘤中表達(dá)降低[5-6],這說明ANXA1在腫瘤的發(fā)生中具有重要影響。鑒于此,本研究通過免疫組化檢測ANXA1在膽囊癌中表達(dá),研究其對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制,以期為膽囊癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1材料

    1.1.1一般資料 收集河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院2014年8月至2016年8月期間進(jìn)行膽囊癌切除手術(shù)的患者100例,其中男性40例,女性60例,年齡范圍31~85歲,平均年齡為65.82歲。術(shù)前未行放化療,術(shù)后病理報(bào)告均為腺癌。術(shù)后按照常規(guī)的病理學(xué)檢查確定組織學(xué)類型、腫瘤的分化程度。按照WHO的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為高(G1,18例)、中(G2,42例)、低(G3,36例)分化組和未分化組(G4,4例)。病理分期按照Nevin標(biāo)準(zhǔn)分為五期,其中0期4例,Ⅰ期23例,Ⅱ期34例,Ⅲ期20例,IV期19例。無淋巴轉(zhuǎn)移41例,有淋巴轉(zhuǎn)移59例。從100例膽囊癌組織臘塊標(biāo)本中隨機(jī)抽取40例,取癌旁組織作為對(duì)照組,其中男性15例,女性25例,平均年齡為61.26歲。所有的樣品采集均經(jīng)過患者及其近親屬的知情同意及河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

    1.1.2細(xì)胞 人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株購自鄭州大學(xué)。

    1.1.3主要試劑和儀器 胎牛血清、胰酶、青鏈霉素均購自美國Gibco公司;活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Cleaved Caspase-3)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)、磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Phosphorylated Signal transducers and activators of transcription 3,p-STAT3)單克隆抗體及ANXA1多克隆抗體和辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自美國abcam公司;小干擾RNA-陰性對(duì)照(siRNA-NC)組、ANXA1-siRNA購自上海生工生物工程有限公司;DAB顯色試劑盒購自TIANGEN BIOTECH北京有限公司;Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cell Counting Kit-8,CCK8)試劑盒購自日本Dongji公司;二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司;酶標(biāo)儀購自TECAN公司;流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

    1.2方法

    1.2.1免疫組化及結(jié)果判定 將厚度為4 μm的蠟塊切片放置于載玻片上,室溫條件下去除液體,脫蠟過程使用二甲苯,脫水過程使用酒精,在3% 雙氧水條件下孵育20 min后,用0.1%的胰蛋白酶消化反應(yīng)15 min,PH7.4的PBS洗滌3遍,甩去PBS液,加入1∶80稀釋的ANXA1多克隆抗體,孵育70 min,重新清洗3次,加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,乙醇脫水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別浸泡2 min、5 min,中性樹膠封片。PBS作為陰性對(duì)照,相應(yīng)抗體的陽性切片作為陽性對(duì)照。以O(shè)lympus數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行采集、分析。隨機(jī)選擇10個(gè)視野,400倍觀察,測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均吸光度值(IOD),根據(jù)IOD統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞的比例。

    1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存于液氮罐中的人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株,置于37 ℃的水浴鍋中溶解,轉(zhuǎn)移溶解的細(xì)胞至一個(gè)新的離心管中,向離心管中加入含有10%胎牛血清、100 mg·L-1鏈霉素和1×105U·L-1青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃,5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿皿底90%以上時(shí),0.25%胰酶消化細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基終止消化,按照實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代。細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期再用于實(shí)驗(yàn)研究。

    1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長至對(duì)數(shù)期的人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞株以106個(gè)/毫升每孔加2 mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明將siRNA-NC(轉(zhuǎn)染對(duì)照)、ANXA1-siRNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),各轉(zhuǎn)染100 nmol·L-1,對(duì)照組不轉(zhuǎn)染,將各組細(xì)胞與培養(yǎng)基充分混合后加入到人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞,置于37 ℃,5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,觀察到細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí),用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,更換成含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.4轉(zhuǎn)染效果檢測 取生長至對(duì)數(shù)期的上述三組細(xì)胞,1 000 r·min-1,離心5 min,加入適量的Trizol置于冰上裂解反應(yīng)30 min后,4 ℃,14 000 r·min-1,離心15 min,吸取蛋白上清液,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒檢測提取的蛋白濃度。將蛋白樣品和上樣緩沖液充分混勻,100 ℃條件下變性5 min,將蛋白加入到SDS-PAGE凝膠孔中進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后4 ℃轉(zhuǎn)膜1.5 h,5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h,以1∶500稀釋的ANXA1單克隆抗體作為一抗,4 ℃孵育過夜,TBST清洗后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h,TBST清洗后加入增強(qiáng)型化學(xué)法(ECL)發(fā)光劑顯影,自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參,分析蛋白表達(dá)水平。

    1.2.5細(xì)胞增殖檢測 將生長至對(duì)數(shù)期的上述三組細(xì)胞,以5×103個(gè)/毫升每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃,5%二氧化碳濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,向每孔細(xì)胞中加入10 μL CCK8溶液,置于37 ℃,5% 二氧化碳培養(yǎng)箱孵育3 h,酶標(biāo)儀在波長為490 nm處測定并記錄OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD/對(duì)照組細(xì)胞OD)×100%

    1.2.6細(xì)胞凋亡檢測 取上述三組細(xì)胞,0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升還有2×105個(gè)細(xì)胞,接種細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h后,取1 mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,4 ℃,1 000 r·min-1,離心8 min,棄上清,洗滌細(xì)胞后加入200 μL結(jié)合緩沖液,然后加入PI和 Annexin-V各5 μL,室溫避光條件下反應(yīng)20 min后,再加入400 μL結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.2.7蛋白質(zhì)印跡法檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 取上述三組細(xì)胞,按照1.2.4的方法檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。觀測資料中的計(jì)量數(shù)據(jù),組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1ANXA1基因在膽囊癌及癌旁組織中的表達(dá)

    ANXA1在膽囊癌中陽性表達(dá)69例,陽性率為69.0%,對(duì)照組陽性表達(dá)3例,陽性率為7.5%,兩組之間ANXA1陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

    表1 ANXA1基因在膽囊癌及癌旁組織中的表達(dá)/例

    注:兩組比較,aχ2=43.261,P<0.01

    2.2ANXA1表達(dá)與膽囊癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系如表2所示,ANXA1在膽囊癌中的表達(dá)與性別、年齡不相關(guān)(P>0.05),與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.01)。

    表2 ANXA1表達(dá)與膽囊癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系/例(%)

    2.3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ANXA1的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖的影響空脂質(zhì)體、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 轉(zhuǎn)染人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞后培養(yǎng)48 h,siRNA-NC組細(xì)胞中ANXA1蛋白表達(dá)率為0.335±0.031,細(xì)胞存活率為(97.02±1.46)%,與對(duì)照組[0.342±0.035,(97.15±1.51)%]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.346);ANXA1-siRNA組細(xì)胞中ANXA1蛋白表達(dá)率為0.141±0.018,細(xì)胞存活率為(51.54±3.31)%,顯著低于對(duì)照組(P=0.003~0.006 )。見圖1。

    2.4抑制ANXA1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測空脂質(zhì)體、siRNA-NC、ANXA1-siRNA 轉(zhuǎn)染人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,siRNA-NC組細(xì)胞凋亡率為(3.42±0.68)%,Cleaved caspase3蛋白表達(dá)率為0.162±0.017,與對(duì)照組[(3.35±0.62)%,0.154±0.015]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.523);ANXA1-siRNA組細(xì)胞凋亡率為(17.14±2.02)%,Cleaved caspase3蛋白表達(dá)為0.411±0.038,顯著高于對(duì)照組(P=0.002~0.005)(圖2)。

    注:1為對(duì)照組,2為siRNA-NC組,3為ANXA1-siRNA組;與對(duì)照組比較,aP=0.002~0.005

    2.5抑制ANXA1的表達(dá)對(duì)STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響蛋白質(zhì)印跡法檢測上述三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,siRNA-NC組STAT3蛋白表達(dá)率為0.468±0.040,p-STAT3蛋白表達(dá)率為0.220±0.031,與對(duì)照組(0.462±0.039,0.216±0.026)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.421);ANXA1-siRNA組p-STAT3蛋白表達(dá)率為0.094±0.011,顯著低于對(duì)照組(P=0.002~0.004),三個(gè)組STAT3蛋白表達(dá)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.332)(圖3)。

    注:1為對(duì)照組,2為siRNA-NC組,3為ANXA1-siRNA組;與對(duì)照組比較,aP=0.002~0.004

    3 討論

    膜聯(lián)蛋白超家族有A、B、C、D、E五組,在人類的組織中僅存在A組,A組有13個(gè)成員,其中ANXA1是最早發(fā)現(xiàn)的成員。ANXA1屬于胞質(zhì)蛋白,在各種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,占細(xì)胞中蛋白質(zhì)總含量的0.5%~2%,它既可以可溶性的形式存在,也可以穩(wěn)定或可逆的形式結(jié)合在細(xì)胞骨架蛋白上[7-8]。其功能具有多樣性,包括參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和分化及信號(hào)傳遞等生命活動(dòng),在不同腫瘤中的表達(dá)有明顯的差異,且在同一種腫瘤的不同形式中也有可能不同。在不同組織中ANXA1的不同表達(dá)均可引起腫瘤的發(fā)生,目前尚無合理的解釋[9-11]。

    注:1為對(duì)照組,2為siRNA-NC組,3為ANXA1-siRNA組;與對(duì)照組比較,aP=0.003~0.006

    本研究中旨在探究ANXA1對(duì)膽囊癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及機(jī)制。研究顯示,ANXA1在食管腺癌中高表達(dá),其表達(dá)與腫瘤的病理分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān),ANXA1的表達(dá)越高,腫瘤的分期越高,腫瘤的復(fù)發(fā)率越高[12]。在鼻咽癌中ANXA1低表達(dá),其表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)ANXA1表達(dá)越低,腫瘤的惡性程度越高[14]。本研究檢測ANXA1在膽囊癌中的陽性表達(dá)及與病理關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,ANXA1在膽囊癌中的陽性表達(dá)顯著高于相應(yīng)的癌旁組織,且表達(dá)與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

    RNA干擾是一種能引起內(nèi)源性靶基因沉默的機(jī)制,是研究基因功能有效的方法[15]。研究顯示,ANXA1在前列腺癌中高表達(dá),沉默ANXA1的表達(dá)后能顯著促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞的凋亡[16]。胰腺癌中沉默ANXA1的表達(dá)能阻滯癌細(xì)胞于G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本研究中,檢測沉默ANXA1的表達(dá)對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖凋亡的影響,結(jié)果顯示,沉默ANXA1的表達(dá)能顯著抑制人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和上調(diào)Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡過程,主要有半胱氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起,caspase3處在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游,為細(xì)胞凋亡過程中的共同效應(yīng)蛋白,被稱為“凋亡的執(zhí)行者”[18-19]。本研究的結(jié)果說明沉默ANXA1的表達(dá),通過上調(diào)Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)引起人膽囊癌細(xì)胞的凋亡。

    酪氨酸激酶JAK/轉(zhuǎn)錄因子STAT(Janus kinase/Signal transducers and activators of transcription 3,JAK/STAT3)是近些年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,由JAKS蛋白家族和STAT蛋白家族組成,該通路與腫瘤的增殖、分化等生物學(xué)特性密切相關(guān)[20]。STAT3是STAT家族中的一員,參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程,該通路受到細(xì)胞因子、生長因子刺激后,可作用于細(xì)胞核內(nèi)的特異性DNA片段,對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控,從而使通路激活,導(dǎo)致細(xì)胞的增殖異常和惡性轉(zhuǎn)化[21]。本研究中檢測沉默ANXA1的表達(dá)對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響,結(jié)果顯示沉默ANXA1的表達(dá)后能顯著抑制p-STAT3蛋白表達(dá)。

    綜上所述,ANXA1基因的表達(dá)參與了膽囊癌的生長、分化和遷移過程,下調(diào) ANXA1的表達(dá)能抑制人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞的增殖,并通過下調(diào)Cleaved caspase3蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與STAT3信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。該研究為膽囊癌的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)。

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