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    育齡婦女葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性分布研究

    2018-06-07 01:48:36李曉娜高秀葉孫茗趙雪杰高航運(yùn)呂毅
    安徽醫(yī)藥 2018年6期

    李曉娜,高秀葉,孫茗,趙雪杰,高航運(yùn),呂毅

    (河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,河南 鄭州 450047)

    研究證實(shí)孕婦機(jī)體葉酸水平不足是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因,葉酸缺乏一般由補(bǔ)充不足和利用能力差兩方面因素引起;遺傳因素會(huì)影響葉酸的利用能力,如葉酸相關(guān)代謝基因功能異常,即便按正常量補(bǔ)充葉酸,也會(huì)造成機(jī)體葉酸水平不足。個(gè)體遺傳因素不同會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)葉酸代謝能力的差異,利用基因檢測(cè)技術(shù)篩查出葉酸利用能力差的高風(fēng)險(xiǎn)人群,依據(jù)檢測(cè)結(jié)果合理補(bǔ)充葉酸,可大大降低神經(jīng)管缺陷的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),另外也可降低孕婦貧血、妊娠高血壓、早期流產(chǎn)、早產(chǎn)等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1-5]。

    亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶。MTHFR和MTRR基因存在多種基因多態(tài)性位點(diǎn),MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)是最常見的突變位點(diǎn)。這些基因多態(tài)性會(huì)影響編碼酶的活性,導(dǎo)致血清中葉酸、維生素B12水平降低,同型半胱氨酸升高[2]。本研究旨在通過分析育齡期婦女MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G 位點(diǎn)多態(tài)性位點(diǎn)分布狀況,篩查出葉酸利用能力差的高風(fēng)險(xiǎn)人群,為其合理增補(bǔ)葉酸提供科學(xué)依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1一般資料依據(jù)患者知情同意及河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),選擇2015年8月至2016年8月在河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院婦科門診進(jìn)行葉酸利用能力基因檢測(cè)的育齡婦女作為研究對(duì)象,納入標(biāo)準(zhǔn)為同意靜脈血采集的人群,排除非鄭州人群及DNA抽提不符合要求者,共計(jì)144例,年齡范圍19~42歲,年齡(27.1±5.2)歲。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1DNA提取 采用乙二胺四乙酸鹽(Ethylenediaminetetraacetic acidm,EDTA)抗凝管抽取受試者3 mL靜脈血,用北京天根公司基因組DNA試劑盒提取DNA,TE(Tris-EDTA)緩沖液溶解,調(diào)節(jié)DNA濃度100 μg·μL-1。

    1.2.2PCR擴(kuò)增 MTHFR C677T的引物(北京六合華大基因科技有限公司):正向引物FP:5-CCCCAAAGCAGAGGACTCTCTCTG-3;反向引物RP:5-CGAGGACGGTGCGGTGAGAGT-3;MTHFRA1298C的引物(華大科技):正向引物FP:5-GCACGTCCCTCTGTCAGGAGTGTG-3;反向引物RP:5-TTGCCATGTCCACAGCATGGAG-3;MTRR A66G的引物(華大科技):正向引物FP:5-CATGCCTTGAAGTGATGAGGAGGC-3;反向引物RP:5-ACTTGTTCTCACCCTGTG-3;反應(yīng)體系含純水8.5 μL,Ex Taq酶12.5 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,DNA模板2 μL,總反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min后4 ℃保存。

    1.2.3對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序 將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)(北京六合華大基因科技有限公司)。

    2 結(jié)果

    2.1Sanger測(cè)序結(jié)果分析PCR產(chǎn)物經(jīng)Sanger測(cè)序后,通過峰圖比對(duì)可清晰的區(qū)分出該樣本攜帶的不同基因型:野生純合、雜合、突變純合。經(jīng)過數(shù)據(jù)綜合,每個(gè)樣本在MTHFR基因 C677T、A1298C和MTRR 基因A66G位點(diǎn)的分析數(shù)據(jù)均被獲得。各種突變參見圖1~3。

    圖1 部分樣品MTHFR基因C677T結(jié)果

    圖2 部分樣品MTHFR基因A1298C結(jié)果

    圖3 部分樣品MTRR基因A66G結(jié)果

    2.2MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G基因多態(tài)性分布統(tǒng)計(jì)144例正常育齡婦女MTHFR基因 C677T、A1298C位點(diǎn)的基因型分布發(fā)現(xiàn),MTHFR基因C677T位點(diǎn)在育齡婦女中的多態(tài)性,野生純合(CC)、雜合(CT)、純合突變(TT)基因型頻率分別為21.5%、40.3%、38.2%,C/T等位基因型頻率為42.0%、58.0%;MTHFR基因A1298C位點(diǎn)在育齡婦女中的多態(tài)性,野生純合(AA)、雜合(AC)、純合突變(CC)基因型的頻率分別為75.0%、22.2%、2.8%;A/C等位基因型頻率為86.0%、14.0%;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)677CT與1298AC復(fù)合突變有23例;分析144例育齡婦女MTRR A66G位點(diǎn)基因多態(tài)性,AA、AG、GG基因型頻率分別為63.2%、31.3%、5.6%。A、G等位基因型頻率為78.0%、22.0%。

    假設(shè)每個(gè)位點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立,依據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心葉酸利用能力的研究得出的結(jié)論,我們對(duì)MTHFR基因 C677T、A1298C、MTRR A66G三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行綜合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果把個(gè)體葉酸利用能力的風(fēng)險(xiǎn)分為未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)、低度風(fēng)險(xiǎn)、中度風(fēng)險(xiǎn)和高度風(fēng)險(xiǎn),指導(dǎo)個(gè)體實(shí)現(xiàn)個(gè)性化補(bǔ)充葉酸。

    3 討論

    基因的多態(tài)性在人類基因組中非常普遍,在某些情況下,基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物活性發(fā)生改變。遺傳變異(多態(tài)性)在人類基因組中十分普遍,在某些情況下,可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物活性改變。當(dāng)MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)發(fā)生突變,可能導(dǎo)致血清中葉酸、維生素B12水平的降低,及同型半胱氨酸升高等一系列改變[6]。葉酸缺乏會(huì)影響母嬰健康,早期可能引起自然流產(chǎn),孕中晚期引起孕婦胎盤早剝、巨幼細(xì)胞性貧血、妊娠期高血壓等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),我國婦幼保健中心建議備孕婦女孕前3個(gè)月開始服用增補(bǔ)400 μg葉酸,增補(bǔ)到孕3個(gè)月一般繼續(xù)增補(bǔ),但隨著胎兒生長(zhǎng)發(fā)育,母體的血容量、乳房、胎盤的發(fā)育使得葉酸的需要量大增,如孕婦同時(shí)伴有葉酸相關(guān)代謝基因的突變,更易造成葉酸不足[7-8];孕婦體內(nèi)葉酸含量不足胎兒則有發(fā)生神經(jīng)管畸形、唐氏綜合征、唇腭裂、先心病的可能[1]。

    本研究通過對(duì)育齡婦女進(jìn)行MTHFR基因和MTRR基因多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T位點(diǎn)CC、CT、TT基因型頻率分別為21.5%、40.3%、38.2%。TT型所占比例與已知的山東濰坊41.82%[9]接近,高于西安、廣西地區(qū)TT基因型頻率(分別為19.9%、15.7%)[10-11];我們認(rèn)為,采樣人群不同、研究地區(qū)不同都可能造成研究結(jié)果的差異。研究發(fā)現(xiàn)[12],攜帶677TT純合子基因型時(shí)其體內(nèi)MTHFR酶活性僅為45%,1298AC雜合子基因型其體內(nèi)MTHFR酶活性為68%,而(677CT+1298AC)復(fù)合雜合子基因型個(gè)體MTHFR酶活性為41%。677CT和677TT變異基因型發(fā)生較高人群的血清葉酸濃度會(huì)顯著降低,同型半胱氨酸水平會(huì)升高,這些改變與巨幼細(xì)胞性貧血密切相關(guān)[13-16]。

    綜上所述,通過葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)提示有部分育齡期婦女存在葉酸代謝障礙,加之妊娠3個(gè)月后不再增補(bǔ)葉酸,容易造成葉酸缺乏。對(duì) MTHFR基因、MTRR基因相關(guān)位點(diǎn)的檢測(cè),可直接評(píng)估個(gè)體的葉酸利用能力,實(shí)現(xiàn)個(gè)性化增補(bǔ)葉酸,使體內(nèi)葉酸維持在適宜水平,為今后開展優(yōu)生優(yōu)育保健工作提供比較有價(jià)值的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)方面的參考依據(jù)。

    [1] JAMES A.GREENBERG,STACEY J.BELL,YONG GUAN,等.孕期補(bǔ)充葉酸:不僅僅是預(yù)防神經(jīng)管缺陷[J].婦產(chǎn)與遺傳(電子版),2012,2(3):53-59.DOI:10.3868/j.issn.2095-1558.2012.03.014.

    [2] 侯書寧.葉酸基因多態(tài)性和唐氏綜合征高危風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性研究[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016,37(22):3120-3122.

    [3] 李茜西,伍萍芝,何琳琳,等.葉酸代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性與不良孕產(chǎn)發(fā)生易感性的關(guān)系[J].重慶醫(yī)學(xué),2015,44(10):1330-1333.

    [4] 安樂,焦曉輝,米娜,等.MTHFR基因多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的相關(guān)性研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2016,32(5):722-725.

    [5] 謝曉媛,張穎,辛力,等.葉酸代謝酶MTHFR、MTRR基因多態(tài)性與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系[J].天津醫(yī)藥,2016,44(10):1243-1246.

    [6] 楊靈紅,白潔,王德堂,等.西安地區(qū)妊娠孕婦不同孕期血清鐵蛋白、葉酸和維生素B12的水平及臨床意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(6):1088-1090.

    [7] 何敏,向林.重慶地區(qū)妊娠婦女早中孕期葉酸水平分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2014,11(11):2983-2984.

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