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    幽門螺桿菌通過NF-κB信號通路調控胃上皮細胞自噬及凋亡的機制研究

    2018-06-07 01:48:35沈書旭
    安徽醫(yī)藥 2018年6期
    關鍵詞:通路蛋白細胞

    沈書旭

    (營口市中心醫(yī)院醫(yī)務部,遼寧 營口 115001)

    幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是導致慢性胃炎及胃潰瘍的主要因素,胃黏膜相關的淋巴組織癌變及胃癌的發(fā)生也與其息息相關,幽門螺桿菌已成為Ⅰ類致癌因子[1-2]。我國Hp感染率約為53%,且呈上升趨勢[3],Hp感染已嚴重威脅著人類的健康,目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的、徹底清除Hp的方法,而且關于Hp的致病機制目前還不明確,因此深入探究Hp感染機制,揭示致病機制,對于找到有效治療Hp感染的方法具有重要意義。

    自噬是機體自我保護的免疫防御機制,參與調控機體的生長、分化、發(fā)育過程及多種疾病的發(fā)生過程,對抵抗病原體感染具有重要作用[4-5]。凋亡是受基因調控的細胞程序性死亡進程,研究發(fā)現(xiàn),Hp感染陽性患者中胃黏膜細胞的凋亡率顯著高于感染陰性的患者[6]。細菌感染導致的自噬與凋亡可作為宿主細胞炎癥發(fā)生的觸發(fā)開關,但是關于Hp感染所致胃上皮細胞自噬與凋亡的機制還不清楚,本研究通過Hp體外感染人胃上皮細胞AGS,研究了Hp感染對AGS細胞自噬與凋亡的關系,并結合NF-κB特異性抑制劑SN50探討了可能的作用機制,以期為臨床預防和治療Hp感染提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料與儀器Hp菌株購自美國ATCC;人胃上皮細胞株AGS購自中國科學院上海細胞所;F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone;胎牛血清購自美國Gibico;萬古霉素(K0059)、多黏菌素(P1004)、吖啶橙(BNN2017)購自美國Sigma;Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 ,LC3)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、p65、p-p65、β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Santa Cruz;Annexin V-FITC/PI 雙染凋亡檢測試劑盒購于Biouniquer Technology;FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD;Sorcere Sorcere全自動菌落計數(shù)儀購自英國Sorcere;GDS7500紫外凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國UVP。

    1.2方法

    1.2.1Hp菌株培養(yǎng) 自液氮罐中取出凍存的Hp菌種,迅速置于37 ℃水浴鍋中輕輕震蕩使其充分融化。3 000 r·min-1離心5 min后,吸取50 μL后棄去上清液,吹打混勻后劃線將Hp接種至腦心浸液血瓊脂平板,置于37 ℃,微需氧(10%二氧化碳、5%氧氣、85%氮氣)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h。挑取菌落至20 mL無菌Hp液體培養(yǎng)基中,置于三氣培養(yǎng)箱的搖床上,微需氧條件,37 ℃,100 r·min-1培養(yǎng)24~30 h。

    1.2.2胃上皮細胞AGS培養(yǎng) 自液氮罐中取出凍存的AGS細胞,迅速放入37 ℃水浴鍋中輕輕震蕩使其充分融化,轉移至離心管中與F12培養(yǎng)基混勻后離心收集細胞沉淀,使用新鮮的細胞培養(yǎng)基重懸沉淀,取重懸液加入含10%胎牛血清的F12細胞培養(yǎng)液中,置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長至皿底80%時,棄去舊培養(yǎng)液,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后,0.25%的胰蛋白酶消化并收集細胞,細胞培養(yǎng)液重懸后按1∶4進行傳代培養(yǎng)。

    1.2.3Hp感染AGS細胞方法 取對數(shù)生長期的AGS細胞,0.25%胰酶消化后離心收集細胞,細胞培養(yǎng)液重懸后顯微鏡下調整細胞濃度為2×105個/毫升,每孔2 mL接種于6孔板中,置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)Hp 24 h,紫外分光光度計檢測細菌濃度(1A600=1×108CFU·mL-1)。待AGS細胞生長至皿底80%時,更換新鮮培養(yǎng)基,并按照細菌數(shù):細胞數(shù)=100∶1加入Hp菌懸液,置于37 ℃,5% 二氧化碳條件下共培養(yǎng)0 h、3 h、6 h、9 h。

    1.2.4流式細胞儀檢測AGS細胞自噬 分別向Hp時間梯度處理的AGS細胞、對照組AGS細胞、18 μmol·L-1SN50處理6 h的AGS細胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共處理6 h的AGS細胞中加入終濃度為1 mg·mL-1的吖啶橙溶液,37 ℃避光孵育15 min后,0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞,PBS清洗1~2次,向細胞中加入100 μL預冷的PBS溶液重懸沉淀,流式細胞儀檢測陽性熒光細胞率。

    1.2.5流式細胞儀檢測AGS細胞凋亡 分別取Hp時間梯度處理的AGS細胞、對照組AGS細胞、18 μmol·L-1SN50處理6 h的AGS細胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共處理6 h的AGS細胞,0.25%胰酶消化后顯微鏡下調整細胞濃度為2×106個/毫升,取1 mL細胞懸液離心并收集沉淀,PBS清洗2次后,加入500 μL結合緩沖液重懸細胞,加入10 μL磷脂結合蛋白Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混勻,室溫避光孵育15 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

    1.2.6蛋白質印跡法檢測蛋白表達 取Hp時間梯度處理的AGS細胞,0.25%胰酶消化后收集細胞沉淀,加入細胞裂解液后冰上放置30 min,4 ℃,12 000 r·min-1離心20 min取上清液,BCA法檢測上清中的蛋白濃度。取50 μg蛋白按照體積比4∶1加入5×上樣緩沖液,100 ℃煮沸5 min制備蛋白樣品。蛋白上樣后豎直電泳,80 V電泳30 min后,換用120 V繼續(xù)電泳,直至溴酚藍跑出玻璃板。取出蛋白膠,冰浴條件下100 V轉膜,5%脫脂奶粉室溫孵育6 h,分別加入相應的一抗(1∶500)4 ℃震蕩培養(yǎng)過夜,TBST洗滌液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h,TBST洗滌液清洗后加入ECL發(fā)光劑進行顯影,利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

    2 結果

    2.1Hp感染對AGS細胞自噬的影響利用吖啶橙標記Hp刺激0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS細胞,流式細胞儀檢測陽性熒光細胞率分別為0 h(7.25±1.56)%、3 h(12.86±1.78)%、6 h(28.65±2.14)%、9 h(31.19±2.12)%,統(tǒng)計結果如圖1所示。4個時間段整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=112.723,P=0.000),Hp刺激后AGS細胞自噬率隨著Hp作用時間的延長逐漸升高,Hp刺激3 h、6 h、9 h與0 h相比均差異有統(tǒng)計學意義(t1=3.587,P1=0.007;t2=13.683,P2=0.000;t3=15.307,P3=0.000)。

    注:與0 h相比,aP<0.05

    2.2Hp感染對AGS細胞凋亡的影響收集Hp刺激0、3、6、9 h的AGS細胞,流式細胞儀檢測各時間點AGS細胞凋亡率分別為0 h(9.25±1.56)%、3 h(14.86±1.78)%、6 h(29.65±2.14)%、9 h(33.19±2.12)%,結果如圖2所示。4個時間段整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=108.205,P=0.000),Hp刺激后AGS細胞凋亡率隨著Hp作用時間的延長逐漸增加,Hp刺激3 h、6 h、9 h與0 h相比均差異有統(tǒng)計學意義(t1=3.587,P1=0.007;t2=13.044,P2=0.000;t3=15.307,P3=0.000)。

    注:與0 h相比,at=4.53~8.22,P=0.001~0.004

    2.3Hp感染對自噬及凋亡相關蛋白表達的影響

    收集Hp處理0 h、3 h、6 h、9 h的AGS細胞,提取各組細胞總蛋白,蛋白質印跡法檢測各組細胞自噬及凋亡蛋白表達情況,結果如圖3所示。自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ及凋亡相關蛋白Bax的表達隨著Hp刺激時間的延長逐漸增高,其中Hp處理0 h、3 h、6 h、9 h時Beclin1的蛋白表達分別為(0.103±0.034)%、(0.276±0.046)%、(0.512±0.041)%、(0.579±0.036)%,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達分別為(0.179±0.084)%、(0.667±0.076)%、(2.987±0.120)%、(3.253±0.109)%,Bax蛋白表達分別為(0.127±0.014)%、(0.254±0.026)%、(0.413±0.021)%、(0.506±0.026)%,Bcl-2蛋白表達分別為0 h(0.453±0.023)%、3h(0.321±0.024)%、6 h(0.176±0.016)%、9 h(0.112±0.016)%。Hp處理3 h、6 h、9 h時Beclin1的蛋白表達、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達、Bax蛋白表達和Bcl-2蛋白表達分別整體比較均差異有統(tǒng)計學意義(F1=92.140,P1=0.000;F2=759.672,P2=0.000;F3=170.437,P3=0.000;F4=172.688,P4=0.000)。三者表達均顯著高于0 h時 Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bax的蛋白表達(tBeclin1 3 h=5.361,PBeclin1 3 h=0.001;tBeclin1 6 h=12.673,PBeclin1 6 h=0.000;tBeclin1 9 h=14.750,PBeclin1 9 h=0.000;tLC3Ⅱ3 h=6.044,PtLC3Ⅱ3 h=0.000;tLC3Ⅱ6 h=34.779,PtLC3Ⅱ6 h=0.000;tLC3Ⅱ9 h=38.073,PtLC3Ⅱ9 h=0.000;tBax3 h,=6.975,PBax3 h=0.000;tBax6 h=15.708,PBax6 h=0.000;tBax9 h=20.816,PBax9 h=0.000),而凋亡相關蛋白Bcl-2蛋白表達隨著Hp作用時間的延長逐漸降低,在3 h、6 h、9 h蛋白表達顯著低于與0 h蛋白表達(tBcl-2 3 h=8.041,PBcl-2 3 h=0.000;tBcl-2 6 h=16.873,PBcl-2 6 h=0.000;tBcl-2 9 h=20.772,PBcl-2 9 h=0.000)。

    注:與0 h相比,aP<0.05

    2.4Hp感染對NF-κB通路蛋白表達的影響Hp作用于AGS細胞0 h、3 h、6 h、9 h后,收集各組細胞提取各組總蛋白,蛋白質印跡法檢測各個時間點p65、p-p65蛋白表達變化,并進行統(tǒng)計,0 h、3 h、6 h、9 h四個時間段內p65和p-p65的蛋白表達分別為(0.678±0.030)%、(0.673±0.034)%、(0.664±0.037)%、(0.681±0.041)%,(0.100±0.011)%、(0.211±0.015)%、(0.387±0.026)%、(0.415±0.031)%,結果如圖4所示。p65蛋白表達在0 h、3 h、6 h、9 h間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.130,P=0.940),p-p65蛋白表達在0 h、3 h、6 h、9 h蛋白表達具有明顯變化,整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=134.791,P=0.000),其中Hp作用3 h時即開始顯著增高(t=6.109,P=0.000),其表達隨著Hp作用時間的延長明顯增強。

    注:與0 h相比,aP<0.05

    2.5Hp感染聯(lián)合NF-κB抑制劑對AGS細胞自噬及凋亡的影響為了檢測Hp感染是否通過NF-κB信號通路促進AGS細胞自噬與凋亡,利用NF-κB通路抑制劑SN50與Hp共處理AGS細胞6 h,并檢測各組細胞的自噬及凋亡情況,結果如圖5所示。對照組、Hp、SN50處理后以及Hp與SN50聯(lián)合處理后AGS細胞自噬與凋亡率分別為(11.76±1.70)%,(13.25±1.56)%,(28.65±2.14)%,(29.65±2.14)%,(6.56±1.40)%,(9.86±1.78)%,(19.65±2.14)%,(20.65±2.14)%,4組AGS細胞自噬與凋亡率分別整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F1=79.582,P1=0.000,F(xiàn)2=67.421,P2=0.000)。與對照組AGS細胞自噬與凋亡相比,Hp處理AGS細胞自噬與凋亡顯著增強(t1=11.054,P1=0.000;t2=10.456,P2=0.000);SN50處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著減弱(t1=3.403,P1=0.009;t2=2.799,P2=0.023);Hp與SN50聯(lián)合處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著高于對照組,但低于Hp單獨處理組,差異有統(tǒng)計學意義(t1=5.164,P1=0.001;t2=5.890,P2=0.000;t3=4.718,P3=0.002;t4=5.738,P4=0.000)。

    注:與對照組相比,at=5.46~8.34,P =0.001~0.003;與Hp組相比,bt=4.23~8.56,P=0.001~0.004

    3 討論

    自噬是在真核細胞中普遍存在的一種現(xiàn)象,依賴于溶酶體的自我消化及再循環(huán)機制,進化過程中高度保守[7]。自噬的發(fā)生起始于自噬體的形成,自噬體由細胞雙層膜包裹待降解物形成,自噬體形成后與溶酶體融合后被消化降解[8]。自噬能平衡細胞合成和代謝,起到穩(wěn)定細胞內環(huán)境的作用,自噬還參與調控細胞的固有免疫及獲得性免疫應答過程[9-10]。

    Hp感染胃上皮細胞后,細胞為了清除病原菌會誘發(fā)自噬的產生,以降解病原體及其所分泌的毒性物質,保護胃上皮細胞[11]。吖啶橙能進入溶酶體和自噬體中并能發(fā)生質子化,經吖啶橙標記的細胞無自噬溶酶體產生時呈現(xiàn)綠色,反之則呈現(xiàn)紅色,流式細胞儀用于定量檢測吖啶橙標記的陽性熒光細胞率,即為細胞的自噬率[12]。本研究通過吖啶橙標記Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS細胞,流式細胞儀檢測自噬細胞率,結果顯示,Hp刺激3 h后,AGS細胞即出現(xiàn)自噬現(xiàn)象,細胞自噬率隨著Hp作用時間的延長逐漸升高,6 h時細胞自噬率達到高峰,隨后開始下降,說明細胞感染Hp早期即可快速啟動自噬的發(fā)生,以促進對病原菌的清除。Beclin 1蛋白參與形成自噬前體,引導與自噬相關的蛋白定位于自噬體膜上,從而促進自噬的進行,是調節(jié)自噬發(fā)生的重要因子,其表達在一定程度上反應了自噬的活性[13-14]。微管相關蛋白(microtubule associate protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)主要定位于前自噬泡及自噬泡膜的表面,參與形成自噬體,是自噬體特異性標記蛋白[15],LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型,自噬發(fā)生前,LC3蛋白主要以Ⅰ型狀態(tài)存在,自噬發(fā)生時Ⅰ型蛋白與自噬泡膜表面的PE結合形成Ⅱ型蛋白,結合到自噬體膜上[16]。本研究結果顯示噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表達逐漸隨著Hp刺激時間的延長逐漸增高,LC3Ⅰ蛋白表達隨著Hp作用時間的延長逐漸降低,Hp處理6 h對蛋白表達作用效果最顯著。說明Hp感染AGS細胞后促進了自噬的發(fā)生。

    細胞凋亡是細胞受基因調控的主動性死亡過程,機體通過凋亡清除掉機體內衰老及畸形細胞[17]。Hp感染胃上皮細胞后,會誘使凋亡的產生以清除病變細胞。利用Annexin V-FITC/PI雙染色標記Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h細胞,流式細胞儀檢測凋亡細胞,結果顯示,Hp感染3h細胞凋亡率出現(xiàn)顯著增加,6 h時凋亡率變化最顯著。Bcl-2家族是調節(jié)細胞凋亡的關鍵原件,其家族成員Bcl-2和Bax與細胞凋亡密切相關。Bcl-2蛋白可能通過阻斷細胞程序性死亡的一個早期環(huán)節(jié)阻遏細胞凋亡。Bax蛋白在細胞中通過與Bcl-2蛋白形成二聚體,使Bcl-2蛋白失活,從而調控細胞凋亡[18]。本研究結果顯示,Hp感染3 h后Bax的表達顯著增加,6 h時變化最顯著,Bcl-2蛋白表達則隨著Hp作用時間的延長逐漸降低。說明Hp感染AGS細胞后促進了凋亡的發(fā)生。

    NF-κB信號通路廣泛參與機體的感染、免疫及凋亡進程,被認為在慢性炎癥轉變?yōu)榘┌Y的進程中具有重要作用[19]。在未受到刺激時,NF-κB二聚體p50/p65與其抑制蛋白IκBα形成多聚體,處于失活狀態(tài),細胞受到病原菌感染等刺激時,IKK活化,使IκBα發(fā)生磷酸化,無活性的多聚體降解,暴露出NF-κB二聚體的核定位序列,二聚體進入核內,與靶蛋白結合,促進下游基因的表達[20]。檢測Hp感染對NF-κB信號通路蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)Hp感染能顯著促進p-p65蛋白的表達,且隨著刺激時間的延長蛋白表達也隨之增強。說明Hp感染能影響NF-κB信號通路蛋白的表達,為了進一步驗證Hp感染是否通過NF-κB信號通路調控AGS細胞的自噬與凋亡,本研究利用NF-κB抑制劑SN50與Hp共同作用于AGS細胞,檢測AGS細胞的凋亡與自噬的發(fā)生;結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Hp處理AGS細胞自噬與凋亡顯著增強;SN50處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著減弱;Hp與SN50聯(lián)合處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著高于對照組,但低于Hp單獨處理組,說明Hp感染導致的AGS細胞自噬與凋亡的增強與NF-κB通路的活化有關。

    綜上所述,Hp感染促進胃上皮細胞AGS的自噬與凋亡的發(fā)生,其作用機制與NF-κB通路的活化有關,上述結果可能為臨床開發(fā)新的預防與治療Hp感染的藥物提供理論依據(jù)。

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