• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    幽門螺桿菌通過NF-κB信號通路調控胃上皮細胞自噬及凋亡的機制研究

    2018-06-07 01:48:35沈書旭
    安徽醫(yī)藥 2018年6期
    關鍵詞:通路蛋白細胞

    沈書旭

    (營口市中心醫(yī)院醫(yī)務部,遼寧 營口 115001)

    幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是導致慢性胃炎及胃潰瘍的主要因素,胃黏膜相關的淋巴組織癌變及胃癌的發(fā)生也與其息息相關,幽門螺桿菌已成為Ⅰ類致癌因子[1-2]。我國Hp感染率約為53%,且呈上升趨勢[3],Hp感染已嚴重威脅著人類的健康,目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的、徹底清除Hp的方法,而且關于Hp的致病機制目前還不明確,因此深入探究Hp感染機制,揭示致病機制,對于找到有效治療Hp感染的方法具有重要意義。

    自噬是機體自我保護的免疫防御機制,參與調控機體的生長、分化、發(fā)育過程及多種疾病的發(fā)生過程,對抵抗病原體感染具有重要作用[4-5]。凋亡是受基因調控的細胞程序性死亡進程,研究發(fā)現(xiàn),Hp感染陽性患者中胃黏膜細胞的凋亡率顯著高于感染陰性的患者[6]。細菌感染導致的自噬與凋亡可作為宿主細胞炎癥發(fā)生的觸發(fā)開關,但是關于Hp感染所致胃上皮細胞自噬與凋亡的機制還不清楚,本研究通過Hp體外感染人胃上皮細胞AGS,研究了Hp感染對AGS細胞自噬與凋亡的關系,并結合NF-κB特異性抑制劑SN50探討了可能的作用機制,以期為臨床預防和治療Hp感染提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料與儀器Hp菌株購自美國ATCC;人胃上皮細胞株AGS購自中國科學院上海細胞所;F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone;胎牛血清購自美國Gibico;萬古霉素(K0059)、多黏菌素(P1004)、吖啶橙(BNN2017)購自美國Sigma;Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 ,LC3)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、p65、p-p65、β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Santa Cruz;Annexin V-FITC/PI 雙染凋亡檢測試劑盒購于Biouniquer Technology;FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD;Sorcere Sorcere全自動菌落計數(shù)儀購自英國Sorcere;GDS7500紫外凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國UVP。

    1.2方法

    1.2.1Hp菌株培養(yǎng) 自液氮罐中取出凍存的Hp菌種,迅速置于37 ℃水浴鍋中輕輕震蕩使其充分融化。3 000 r·min-1離心5 min后,吸取50 μL后棄去上清液,吹打混勻后劃線將Hp接種至腦心浸液血瓊脂平板,置于37 ℃,微需氧(10%二氧化碳、5%氧氣、85%氮氣)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h。挑取菌落至20 mL無菌Hp液體培養(yǎng)基中,置于三氣培養(yǎng)箱的搖床上,微需氧條件,37 ℃,100 r·min-1培養(yǎng)24~30 h。

    1.2.2胃上皮細胞AGS培養(yǎng) 自液氮罐中取出凍存的AGS細胞,迅速放入37 ℃水浴鍋中輕輕震蕩使其充分融化,轉移至離心管中與F12培養(yǎng)基混勻后離心收集細胞沉淀,使用新鮮的細胞培養(yǎng)基重懸沉淀,取重懸液加入含10%胎牛血清的F12細胞培養(yǎng)液中,置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長至皿底80%時,棄去舊培養(yǎng)液,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后,0.25%的胰蛋白酶消化并收集細胞,細胞培養(yǎng)液重懸后按1∶4進行傳代培養(yǎng)。

    1.2.3Hp感染AGS細胞方法 取對數(shù)生長期的AGS細胞,0.25%胰酶消化后離心收集細胞,細胞培養(yǎng)液重懸后顯微鏡下調整細胞濃度為2×105個/毫升,每孔2 mL接種于6孔板中,置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)Hp 24 h,紫外分光光度計檢測細菌濃度(1A600=1×108CFU·mL-1)。待AGS細胞生長至皿底80%時,更換新鮮培養(yǎng)基,并按照細菌數(shù):細胞數(shù)=100∶1加入Hp菌懸液,置于37 ℃,5% 二氧化碳條件下共培養(yǎng)0 h、3 h、6 h、9 h。

    1.2.4流式細胞儀檢測AGS細胞自噬 分別向Hp時間梯度處理的AGS細胞、對照組AGS細胞、18 μmol·L-1SN50處理6 h的AGS細胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共處理6 h的AGS細胞中加入終濃度為1 mg·mL-1的吖啶橙溶液,37 ℃避光孵育15 min后,0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞,PBS清洗1~2次,向細胞中加入100 μL預冷的PBS溶液重懸沉淀,流式細胞儀檢測陽性熒光細胞率。

    1.2.5流式細胞儀檢測AGS細胞凋亡 分別取Hp時間梯度處理的AGS細胞、對照組AGS細胞、18 μmol·L-1SN50處理6 h的AGS細胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共處理6 h的AGS細胞,0.25%胰酶消化后顯微鏡下調整細胞濃度為2×106個/毫升,取1 mL細胞懸液離心并收集沉淀,PBS清洗2次后,加入500 μL結合緩沖液重懸細胞,加入10 μL磷脂結合蛋白Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混勻,室溫避光孵育15 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

    1.2.6蛋白質印跡法檢測蛋白表達 取Hp時間梯度處理的AGS細胞,0.25%胰酶消化后收集細胞沉淀,加入細胞裂解液后冰上放置30 min,4 ℃,12 000 r·min-1離心20 min取上清液,BCA法檢測上清中的蛋白濃度。取50 μg蛋白按照體積比4∶1加入5×上樣緩沖液,100 ℃煮沸5 min制備蛋白樣品。蛋白上樣后豎直電泳,80 V電泳30 min后,換用120 V繼續(xù)電泳,直至溴酚藍跑出玻璃板。取出蛋白膠,冰浴條件下100 V轉膜,5%脫脂奶粉室溫孵育6 h,分別加入相應的一抗(1∶500)4 ℃震蕩培養(yǎng)過夜,TBST洗滌液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h,TBST洗滌液清洗后加入ECL發(fā)光劑進行顯影,利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

    2 結果

    2.1Hp感染對AGS細胞自噬的影響利用吖啶橙標記Hp刺激0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS細胞,流式細胞儀檢測陽性熒光細胞率分別為0 h(7.25±1.56)%、3 h(12.86±1.78)%、6 h(28.65±2.14)%、9 h(31.19±2.12)%,統(tǒng)計結果如圖1所示。4個時間段整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=112.723,P=0.000),Hp刺激后AGS細胞自噬率隨著Hp作用時間的延長逐漸升高,Hp刺激3 h、6 h、9 h與0 h相比均差異有統(tǒng)計學意義(t1=3.587,P1=0.007;t2=13.683,P2=0.000;t3=15.307,P3=0.000)。

    注:與0 h相比,aP<0.05

    2.2Hp感染對AGS細胞凋亡的影響收集Hp刺激0、3、6、9 h的AGS細胞,流式細胞儀檢測各時間點AGS細胞凋亡率分別為0 h(9.25±1.56)%、3 h(14.86±1.78)%、6 h(29.65±2.14)%、9 h(33.19±2.12)%,結果如圖2所示。4個時間段整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=108.205,P=0.000),Hp刺激后AGS細胞凋亡率隨著Hp作用時間的延長逐漸增加,Hp刺激3 h、6 h、9 h與0 h相比均差異有統(tǒng)計學意義(t1=3.587,P1=0.007;t2=13.044,P2=0.000;t3=15.307,P3=0.000)。

    注:與0 h相比,at=4.53~8.22,P=0.001~0.004

    2.3Hp感染對自噬及凋亡相關蛋白表達的影響

    收集Hp處理0 h、3 h、6 h、9 h的AGS細胞,提取各組細胞總蛋白,蛋白質印跡法檢測各組細胞自噬及凋亡蛋白表達情況,結果如圖3所示。自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ及凋亡相關蛋白Bax的表達隨著Hp刺激時間的延長逐漸增高,其中Hp處理0 h、3 h、6 h、9 h時Beclin1的蛋白表達分別為(0.103±0.034)%、(0.276±0.046)%、(0.512±0.041)%、(0.579±0.036)%,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達分別為(0.179±0.084)%、(0.667±0.076)%、(2.987±0.120)%、(3.253±0.109)%,Bax蛋白表達分別為(0.127±0.014)%、(0.254±0.026)%、(0.413±0.021)%、(0.506±0.026)%,Bcl-2蛋白表達分別為0 h(0.453±0.023)%、3h(0.321±0.024)%、6 h(0.176±0.016)%、9 h(0.112±0.016)%。Hp處理3 h、6 h、9 h時Beclin1的蛋白表達、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達、Bax蛋白表達和Bcl-2蛋白表達分別整體比較均差異有統(tǒng)計學意義(F1=92.140,P1=0.000;F2=759.672,P2=0.000;F3=170.437,P3=0.000;F4=172.688,P4=0.000)。三者表達均顯著高于0 h時 Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bax的蛋白表達(tBeclin1 3 h=5.361,PBeclin1 3 h=0.001;tBeclin1 6 h=12.673,PBeclin1 6 h=0.000;tBeclin1 9 h=14.750,PBeclin1 9 h=0.000;tLC3Ⅱ3 h=6.044,PtLC3Ⅱ3 h=0.000;tLC3Ⅱ6 h=34.779,PtLC3Ⅱ6 h=0.000;tLC3Ⅱ9 h=38.073,PtLC3Ⅱ9 h=0.000;tBax3 h,=6.975,PBax3 h=0.000;tBax6 h=15.708,PBax6 h=0.000;tBax9 h=20.816,PBax9 h=0.000),而凋亡相關蛋白Bcl-2蛋白表達隨著Hp作用時間的延長逐漸降低,在3 h、6 h、9 h蛋白表達顯著低于與0 h蛋白表達(tBcl-2 3 h=8.041,PBcl-2 3 h=0.000;tBcl-2 6 h=16.873,PBcl-2 6 h=0.000;tBcl-2 9 h=20.772,PBcl-2 9 h=0.000)。

    注:與0 h相比,aP<0.05

    2.4Hp感染對NF-κB通路蛋白表達的影響Hp作用于AGS細胞0 h、3 h、6 h、9 h后,收集各組細胞提取各組總蛋白,蛋白質印跡法檢測各個時間點p65、p-p65蛋白表達變化,并進行統(tǒng)計,0 h、3 h、6 h、9 h四個時間段內p65和p-p65的蛋白表達分別為(0.678±0.030)%、(0.673±0.034)%、(0.664±0.037)%、(0.681±0.041)%,(0.100±0.011)%、(0.211±0.015)%、(0.387±0.026)%、(0.415±0.031)%,結果如圖4所示。p65蛋白表達在0 h、3 h、6 h、9 h間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.130,P=0.940),p-p65蛋白表達在0 h、3 h、6 h、9 h蛋白表達具有明顯變化,整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=134.791,P=0.000),其中Hp作用3 h時即開始顯著增高(t=6.109,P=0.000),其表達隨著Hp作用時間的延長明顯增強。

    注:與0 h相比,aP<0.05

    2.5Hp感染聯(lián)合NF-κB抑制劑對AGS細胞自噬及凋亡的影響為了檢測Hp感染是否通過NF-κB信號通路促進AGS細胞自噬與凋亡,利用NF-κB通路抑制劑SN50與Hp共處理AGS細胞6 h,并檢測各組細胞的自噬及凋亡情況,結果如圖5所示。對照組、Hp、SN50處理后以及Hp與SN50聯(lián)合處理后AGS細胞自噬與凋亡率分別為(11.76±1.70)%,(13.25±1.56)%,(28.65±2.14)%,(29.65±2.14)%,(6.56±1.40)%,(9.86±1.78)%,(19.65±2.14)%,(20.65±2.14)%,4組AGS細胞自噬與凋亡率分別整體比較差異有統(tǒng)計學意義(F1=79.582,P1=0.000,F(xiàn)2=67.421,P2=0.000)。與對照組AGS細胞自噬與凋亡相比,Hp處理AGS細胞自噬與凋亡顯著增強(t1=11.054,P1=0.000;t2=10.456,P2=0.000);SN50處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著減弱(t1=3.403,P1=0.009;t2=2.799,P2=0.023);Hp與SN50聯(lián)合處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著高于對照組,但低于Hp單獨處理組,差異有統(tǒng)計學意義(t1=5.164,P1=0.001;t2=5.890,P2=0.000;t3=4.718,P3=0.002;t4=5.738,P4=0.000)。

    注:與對照組相比,at=5.46~8.34,P =0.001~0.003;與Hp組相比,bt=4.23~8.56,P=0.001~0.004

    3 討論

    自噬是在真核細胞中普遍存在的一種現(xiàn)象,依賴于溶酶體的自我消化及再循環(huán)機制,進化過程中高度保守[7]。自噬的發(fā)生起始于自噬體的形成,自噬體由細胞雙層膜包裹待降解物形成,自噬體形成后與溶酶體融合后被消化降解[8]。自噬能平衡細胞合成和代謝,起到穩(wěn)定細胞內環(huán)境的作用,自噬還參與調控細胞的固有免疫及獲得性免疫應答過程[9-10]。

    Hp感染胃上皮細胞后,細胞為了清除病原菌會誘發(fā)自噬的產生,以降解病原體及其所分泌的毒性物質,保護胃上皮細胞[11]。吖啶橙能進入溶酶體和自噬體中并能發(fā)生質子化,經吖啶橙標記的細胞無自噬溶酶體產生時呈現(xiàn)綠色,反之則呈現(xiàn)紅色,流式細胞儀用于定量檢測吖啶橙標記的陽性熒光細胞率,即為細胞的自噬率[12]。本研究通過吖啶橙標記Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS細胞,流式細胞儀檢測自噬細胞率,結果顯示,Hp刺激3 h后,AGS細胞即出現(xiàn)自噬現(xiàn)象,細胞自噬率隨著Hp作用時間的延長逐漸升高,6 h時細胞自噬率達到高峰,隨后開始下降,說明細胞感染Hp早期即可快速啟動自噬的發(fā)生,以促進對病原菌的清除。Beclin 1蛋白參與形成自噬前體,引導與自噬相關的蛋白定位于自噬體膜上,從而促進自噬的進行,是調節(jié)自噬發(fā)生的重要因子,其表達在一定程度上反應了自噬的活性[13-14]。微管相關蛋白(microtubule associate protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)主要定位于前自噬泡及自噬泡膜的表面,參與形成自噬體,是自噬體特異性標記蛋白[15],LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型,自噬發(fā)生前,LC3蛋白主要以Ⅰ型狀態(tài)存在,自噬發(fā)生時Ⅰ型蛋白與自噬泡膜表面的PE結合形成Ⅱ型蛋白,結合到自噬體膜上[16]。本研究結果顯示噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表達逐漸隨著Hp刺激時間的延長逐漸增高,LC3Ⅰ蛋白表達隨著Hp作用時間的延長逐漸降低,Hp處理6 h對蛋白表達作用效果最顯著。說明Hp感染AGS細胞后促進了自噬的發(fā)生。

    細胞凋亡是細胞受基因調控的主動性死亡過程,機體通過凋亡清除掉機體內衰老及畸形細胞[17]。Hp感染胃上皮細胞后,會誘使凋亡的產生以清除病變細胞。利用Annexin V-FITC/PI雙染色標記Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h細胞,流式細胞儀檢測凋亡細胞,結果顯示,Hp感染3h細胞凋亡率出現(xiàn)顯著增加,6 h時凋亡率變化最顯著。Bcl-2家族是調節(jié)細胞凋亡的關鍵原件,其家族成員Bcl-2和Bax與細胞凋亡密切相關。Bcl-2蛋白可能通過阻斷細胞程序性死亡的一個早期環(huán)節(jié)阻遏細胞凋亡。Bax蛋白在細胞中通過與Bcl-2蛋白形成二聚體,使Bcl-2蛋白失活,從而調控細胞凋亡[18]。本研究結果顯示,Hp感染3 h后Bax的表達顯著增加,6 h時變化最顯著,Bcl-2蛋白表達則隨著Hp作用時間的延長逐漸降低。說明Hp感染AGS細胞后促進了凋亡的發(fā)生。

    NF-κB信號通路廣泛參與機體的感染、免疫及凋亡進程,被認為在慢性炎癥轉變?yōu)榘┌Y的進程中具有重要作用[19]。在未受到刺激時,NF-κB二聚體p50/p65與其抑制蛋白IκBα形成多聚體,處于失活狀態(tài),細胞受到病原菌感染等刺激時,IKK活化,使IκBα發(fā)生磷酸化,無活性的多聚體降解,暴露出NF-κB二聚體的核定位序列,二聚體進入核內,與靶蛋白結合,促進下游基因的表達[20]。檢測Hp感染對NF-κB信號通路蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)Hp感染能顯著促進p-p65蛋白的表達,且隨著刺激時間的延長蛋白表達也隨之增強。說明Hp感染能影響NF-κB信號通路蛋白的表達,為了進一步驗證Hp感染是否通過NF-κB信號通路調控AGS細胞的自噬與凋亡,本研究利用NF-κB抑制劑SN50與Hp共同作用于AGS細胞,檢測AGS細胞的凋亡與自噬的發(fā)生;結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Hp處理AGS細胞自噬與凋亡顯著增強;SN50處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著減弱;Hp與SN50聯(lián)合處理后,AGS細胞自噬與凋亡顯著高于對照組,但低于Hp單獨處理組,說明Hp感染導致的AGS細胞自噬與凋亡的增強與NF-κB通路的活化有關。

    綜上所述,Hp感染促進胃上皮細胞AGS的自噬與凋亡的發(fā)生,其作用機制與NF-κB通路的活化有關,上述結果可能為臨床開發(fā)新的預防與治療Hp感染的藥物提供理論依據(jù)。

    [1] 吳善斌,于曉巖.幽門螺桿菌感染對老年患者胃部黏膜病理學的影響[J].中國老年學雜志,2016,36(13):3227-3228.

    [2] PLUMMER M,FRANCESCHI S,VIGNAT J,et al.Global burden of gastric cancer attributable to Helicobacter pylori[J].International Journal of Cancer,2015,136(2):487-490.

    [3] 項利娟,朱新建,黃德富,等.幽門螺桿菌感染調查與耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2015,25(8):1710-1711,1727.

    [4] KLIONSKY DJ,ABDELMOHSEN K,ABE A,et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J].Autophagy,2016,12(1):1-222.

    [5] SHIBUTANI ST,SAITOH T,NOWAG H,et al.Autophagy and autophagy-related proteins in the immune system[J].Nature Immunology,2015,16(10):1014-1024.

    [6] BOBBA A,AMADORO G,LA PIANA G,et al.Glycolytic enzyme upregulation and numbness of mitochondrial activity characterize the early phase of apoptosis in cerebellar granule cells[J].Apoptosis,2015,20(1):10-28.

    [7] 王賁士,陳德喜,郭洪亮.自噬與腫瘤的研究現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(8):637-640.

    [9] ABDELAZIZ DH ,KHALIL H,CORMET-BOYAKA E,et al.The cooperation between the autophagy machinery and the inflammasome to implement an appropriate innate immune response:do they regulate each other?[J].Immunol Rev,2015,265(1):194-204.

    [10] OWCZARCZYK AB,SCHALLER MA,REED M,et al.Sirtuin 1 regulates dendritic cell activation and autophagy during respiratory syncytial virus-induced immune responses[J].The Journal of Immunology,2015,195(4):1637-1646.

    [11] CASTAO-RODRGUEZ N,KAAKOUSH NO,GOH KL,et al.Autophagy inHelicobacterpyloriinfection and related gastric cancer[J].Helicobacter,2015,20(5):353-369.

    [12] 馮曉蘭,王攀,王筱冰.通過抑制自噬作用增強聲動力學療法誘導的腫瘤細胞凋亡研究[J].中國生物醫(yī)學工程學報,2015,34(1):62-69.

    [13] 李良慶,潘敦,林振孟.自噬相關基因Beclin1和微管相關蛋白輕鏈3在胃癌組織中的表達及臨床意義[J].中華實驗外科雜志,2014,31(3):508-510.

    [14] 張雨睛,張麗慧,魏爾清,等.Beclin 1在凋亡和自噬中的調節(jié)作用[J].中國生物化學與分子生物學報,2015,31(4):331-338.

    [15] HUANG R,XU Y,WAN W,et al.Deacetylation of nuclear LC3 drives autophagy initiation under starvation[J].Mol Cell,2015,57(3):456-466.

    [16] SHARIFI MN,MOWERS EE,DRAKE LE,et al.Autophagy promotes focal adhesion disassembly and cell motility of metastatic tumor cells through the direct interaction of paxillin with LC3[J].Cell Rep,2016,15(8):1660-1672.

    [17] 高薇,侯微,李偉,等.細胞凋亡機制研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41(10):150-156.

    [18] ZHAO B,HE T.Chidamide,a histone deacetylase inhibitor,functions as a tumor inhibitor by modulating the ratio of Bax/Bcl-2 and P21 in pancreatic cancer[J].Oncol Rep,2015,33(1):304-310.

    [19] ZhONG Z,UMEMURA A,SANCHEZ-LOPEZ E,et al.NF-κB restricts inflammasome activation via elimination of damaged mitochondria[J].Cell,2016,164(5):896-910.

    [20] FANG L,CHOUDHARY S,TIAN B,et al.Ataxia telangiectasia mutated kinase mediates NF-κB serine 276 phosphorylation and interferon expression via the IRF7-RIG-I amplification loop in paramyxovirus infection[J].J Vir,2015,89(5):2628-2642.

    猜你喜歡
    通路蛋白細胞
    DANDY CELLS潮細胞
    睿士(2021年5期)2021-05-20 19:13:08
    潮細胞
    睿士(2020年5期)2020-05-21 09:56:35
    細胞知道你缺氧了
    Dandy Cells潮細胞 Finding a home
    睿士(2019年9期)2019-09-10 21:54:27
    豬胎盤蛋白的分離鑒定
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:00
    自噬蛋白Beclin-1在膽囊癌中的表達及臨床意義
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    SAK -HV 蛋白通過上調 ABCG5/ABCG8的表達降低膽固醇的吸收
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細胞增殖
    C-Met蛋白與HGF蛋白在舌鱗癌細胞中的表達及臨床意義
    九九在线视频观看精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日本与韩国留学比较| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av成人精品一二三区| 99国产精品免费福利视频| 99热6这里只有精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 久久 成人 亚洲| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产免费又黄又爽又色| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美日韩成人在线一区二区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品久久久久成人av| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产成人精品福利久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久久久久精品精品| 边亲边吃奶的免费视频| tube8黄色片| 春色校园在线视频观看| 色吧在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日日啪夜夜爽| 免费观看性生交大片5| 欧美日韩精品成人综合77777| 在线精品无人区一区二区三| 成人二区视频| 综合色丁香网| 欧美日韩视频精品一区| 久久av网站| 国产精品久久久久久精品古装| 在线观看美女被高潮喷水网站| 午夜av观看不卡| 91精品三级在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 制服丝袜香蕉在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲综合精品二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲四区av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 少妇精品久久久久久久| 性色avwww在线观看| 国产男人的电影天堂91| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 人妻系列 视频| 欧美性感艳星| 日韩伦理黄色片| 国产免费现黄频在线看| videos熟女内射| 美女cb高潮喷水在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 免费观看av网站的网址| 久久狼人影院| 亚洲人与动物交配视频| 9色porny在线观看| 成人国产麻豆网| 黄色一级大片看看| 国产日韩欧美视频二区| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品国产三级专区第一集| 一个人免费看片子| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av福利一区| 日韩一本色道免费dvd| 大香蕉久久成人网| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av不卡在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 久久精品国产亚洲av涩爱| 两个人免费观看高清视频| 精品久久久噜噜| 久久精品久久久久久久性| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品人妻久久久影院| 中文字幕人妻丝袜制服| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一级爰片在线观看| 国产乱来视频区| 国产亚洲最大av| 男女国产视频网站| 九色成人免费人妻av| 亚洲精品一二三| 亚洲欧洲日产国产| 午夜av观看不卡| 国产av码专区亚洲av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久av网站| 涩涩av久久男人的天堂| 97精品久久久久久久久久精品| 国产综合精华液| 日韩中字成人| 我的老师免费观看完整版| 91精品三级在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 韩国高清视频一区二区三区| 久久午夜福利片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲av国产av综合av卡| 九草在线视频观看| 青春草视频在线免费观看| 嘟嘟电影网在线观看| 在线 av 中文字幕| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲国产精品专区欧美| 最新的欧美精品一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 两个人免费观看高清视频| 热re99久久精品国产66热6| 婷婷色综合www| 日本爱情动作片www.在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲美女黄色视频免费看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 两个人免费观看高清视频| 欧美丝袜亚洲另类| 国产精品熟女久久久久浪| av国产精品久久久久影院| 一边亲一边摸免费视频| 久久精品国产自在天天线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 我的老师免费观看完整版| 久久99一区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品aⅴ在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 免费高清在线观看视频在线观看| 日本色播在线视频| 国产黄色免费在线视频| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 美女国产高潮福利片在线看| 大片免费播放器 马上看| 天美传媒精品一区二区| 一级片'在线观看视频| 桃花免费在线播放| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久人妻熟女aⅴ| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品人妻熟女av久视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 男女免费视频国产| 亚洲av二区三区四区| 麻豆成人av视频| 赤兔流量卡办理| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一级爰片在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 婷婷成人精品国产| 国产 精品1| 丰满少妇做爰视频| av天堂久久9| 国产成人精品婷婷| 亚洲av.av天堂| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 国产成人精品福利久久| 99久久精品一区二区三区| 日本91视频免费播放| 自线自在国产av| 婷婷成人精品国产| 99热6这里只有精品| 免费日韩欧美在线观看| 99九九在线精品视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜日本视频在线| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久久久人妻| 亚洲综合精品二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| freevideosex欧美| 亚洲在久久综合| 国产亚洲一区二区精品| 国产av国产精品国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产日韩欧美亚洲二区| 51国产日韩欧美| 99久久精品国产国产毛片| 大片免费播放器 马上看| 青青草视频在线视频观看| 欧美国产精品一级二级三级| 一本色道久久久久久精品综合| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品成人在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 18+在线观看网站| 国产成人精品一,二区| 国产深夜福利视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 一级黄片播放器| 狂野欧美激情性bbbbbb| 成人二区视频| 97在线人人人人妻| 日韩欧美一区视频在线观看| 尾随美女入室| 免费av不卡在线播放| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产高清有码在线观看视频| 国产免费视频播放在线视频| 简卡轻食公司| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一个人免费看片子| av在线老鸭窝| 国产淫语在线视频| 两个人免费观看高清视频| 久久亚洲国产成人精品v| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 成年人免费黄色播放视频| 看免费成人av毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99国产综合亚洲精品| 日本-黄色视频高清免费观看| av黄色大香蕉| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美成人午夜免费资源| 成人综合一区亚洲| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 免费人成在线观看视频色| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人一区二区在线| 免费大片黄手机在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 女性生殖器流出的白浆| 99视频精品全部免费 在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久99一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲精品自拍成人| 91国产中文字幕| 又大又黄又爽视频免费| 日本vs欧美在线观看视频| 在线观看三级黄色| 777米奇影视久久| 精品久久国产蜜桃| videossex国产| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 69精品国产乱码久久久| 国产一区二区在线观看av| 国产精品人妻久久久影院| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 高清欧美精品videossex| 久久国内精品自在自线图片| 国产片特级美女逼逼视频| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 中文字幕久久专区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 女性生殖器流出的白浆| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜日本视频在线| 少妇丰满av| 一级a做视频免费观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜影院在线不卡| 在线精品无人区一区二区三| 人体艺术视频欧美日本| 免费人妻精品一区二区三区视频| 七月丁香在线播放| 国产高清国产精品国产三级| 毛片一级片免费看久久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| av专区在线播放| 久久久久久久久久久免费av| 男女边摸边吃奶| 亚洲精品乱久久久久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 51国产日韩欧美| 精品久久久噜噜| 久久久久久久久久人人人人人人| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人漫画全彩无遮挡| 五月天丁香电影| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日本黄色片子视频| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品三级大全| av国产久精品久网站免费入址| 久久精品国产亚洲网站| 免费人成在线观看视频色| 久久久国产精品麻豆| 精品久久久久久久久亚洲| 美女福利国产在线| 91成人精品电影| 亚洲av欧美aⅴ国产| 中文字幕最新亚洲高清| 婷婷色av中文字幕| 伦理电影大哥的女人| 国产精品一国产av| 丝袜美足系列| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产视频首页在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 中文字幕亚洲精品专区| 在线播放无遮挡| 欧美精品一区二区大全| 大码成人一级视频| 一区二区三区免费毛片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 中国美白少妇内射xxxbb| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品人妻久久久影院| 久久韩国三级中文字幕| 超碰97精品在线观看| 尾随美女入室| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品熟女久久久久浪| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 大片电影免费在线观看免费| 午夜激情av网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品无大码| 天堂8中文在线网| 国产精品久久久久久久久免| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩在线观看h| 亚洲成人手机| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲国产欧美在线一区| 黑人猛操日本美女一级片| 九色成人免费人妻av| 一级a做视频免费观看| 国产精品久久久久成人av| 97在线人人人人妻| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 成人国语在线视频| 亚洲高清免费不卡视频| videos熟女内射| 国产免费福利视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 人妻少妇偷人精品九色| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美日韩在线观看h| 久久 成人 亚洲| 久久久久久久久久久丰满| 妹子高潮喷水视频| 精品人妻在线不人妻| 在线天堂最新版资源| 国产一区二区在线观看日韩| 毛片一级片免费看久久久久| 97在线人人人人妻| 国产免费福利视频在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 两个人免费观看高清视频| av在线观看视频网站免费| 国产黄片视频在线免费观看| 高清毛片免费看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩av免费高清视频| 秋霞在线观看毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久精品国产自在天天线| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲图色成人| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品午夜福利在线看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲性久久影院| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲综合精品二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品成人在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 午夜影院在线不卡| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 伊人久久国产一区二区| 两个人的视频大全免费| 99九九线精品视频在线观看视频| 成年av动漫网址| 在线看a的网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 女人精品久久久久毛片| 午夜福利影视在线免费观看| 国产高清三级在线| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 交换朋友夫妻互换小说| 一本一本综合久久| 99国产综合亚洲精品| 国产精品女同一区二区软件| 国产成人精品一,二区| 日韩中字成人| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产成人a∨麻豆精品| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲欧洲国产日韩| 插阴视频在线观看视频| 久久久久久久久久久久大奶| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线观看人妻少妇| 精品国产一区二区久久| 欧美 日韩 精品 国产| 在线观看免费日韩欧美大片 | 99热国产这里只有精品6| 极品少妇高潮喷水抽搐| 男女边吃奶边做爰视频| 国产探花极品一区二区| av电影中文网址| 欧美精品一区二区大全| 超碰97精品在线观看| 亚洲美女视频黄频| 青春草视频在线免费观看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产在线免费精品| 国产亚洲精品久久久com| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲成人一二三区av| 亚洲国产av新网站| 精品一品国产午夜福利视频| 午夜免费鲁丝| 黑丝袜美女国产一区| 美女国产高潮福利片在线看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 99re6热这里在线精品视频| av卡一久久| 在线看a的网站| 人妻系列 视频| 人人妻人人澡人人看| 国产免费又黄又爽又色| 人人澡人人妻人| 老司机影院毛片| 丝袜脚勾引网站| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 十八禁网站网址无遮挡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 男的添女的下面高潮视频| 超碰97精品在线观看| www.色视频.com| 午夜免费观看性视频| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲中文av在线| 春色校园在线视频观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲不卡免费看| 精品午夜福利在线看| 亚洲三级黄色毛片| 精品少妇久久久久久888优播| 老司机影院毛片| 精品人妻熟女av久视频| 观看av在线不卡| 涩涩av久久男人的天堂| 中文字幕最新亚洲高清| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| a级毛片黄视频| 成人黄色视频免费在线看| 丁香六月天网| 久久ye,这里只有精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美3d第一页| 日日撸夜夜添| 久久婷婷青草| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日本vs欧美在线观看视频| 伦精品一区二区三区| 午夜91福利影院| 国产永久视频网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 人妻一区二区av| 午夜老司机福利剧场| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲综合色网址| 97超碰精品成人国产| 91精品国产国语对白视频| 交换朋友夫妻互换小说| a级毛色黄片| 七月丁香在线播放| 色5月婷婷丁香| av电影中文网址| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 久久精品久久久久久久性| 女人精品久久久久毛片| 色5月婷婷丁香| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 只有这里有精品99| 精品亚洲成国产av| 国产男女内射视频| 国产精品99久久久久久久久| 午夜91福利影院| 国产极品天堂在线| 久久久国产欧美日韩av| 视频中文字幕在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 中文字幕制服av| 亚洲内射少妇av| 91精品三级在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 中文欧美无线码| 日本欧美视频一区| 高清不卡的av网站| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲国产精品国产精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产男人的电影天堂91| 大香蕉久久网| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲久久久国产精品| 亚洲av免费高清在线观看| 69精品国产乱码久久久| 久久这里有精品视频免费| 99久久综合免费| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 丝袜喷水一区| av在线播放精品| 久久热精品热| 极品少妇高潮喷水抽搐| 视频中文字幕在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 99久久人妻综合| 18禁在线播放成人免费| 满18在线观看网站| 中文字幕免费在线视频6| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 18+在线观看网站| 亚洲国产最新在线播放| 国产一区二区三区av在线| 男女无遮挡免费网站观看| 热re99久久国产66热| 伊人亚洲综合成人网| 免费黄网站久久成人精品| 成人影院久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久精品94久久精品| 国产av码专区亚洲av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 多毛熟女@视频| 九九在线视频观看精品| 91精品国产九色| 黑人猛操日本美女一级片| 精品国产露脸久久av麻豆| 香蕉精品网在线| 久久久精品94久久精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜精品国产一区二区电影| 久久ye,这里只有精品| 永久网站在线| 亚洲不卡免费看| 亚洲情色 制服丝袜| 边亲边吃奶的免费视频| 高清在线视频一区二区三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 交换朋友夫妻互换小说| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| av在线老鸭窝| 91久久精品国产一区二区成人| 蜜臀久久99精品久久宅男| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一区二区三区免费毛片| 日本色播在线视频|