黃地安消膠囊調(diào)控磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路減輕GK大鼠血管病變損傷程度的研究

韓利平，郭明飛，高家榮,，姜輝，方朝暉，單莉，姜楠楠

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038; 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種以高血糖為臨床特征的代謝性疾病[1]，其中2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)占其發(fā)病率的90%以上[2]。糖尿病血管病變以平滑肌細(xì)胞、纖維肌細(xì)胞的異常增殖所致的血管中膜增厚，外膜纖維化與鈣化為其病理學(xué)特征，是T2DM的主要并發(fā)癥之一。黃地安消膠囊為國家中醫(yī)臨床研究基地(重點(diǎn)研究病種：糖尿病)的特色中藥制劑，對T2DM血管病變具有很好的防治作用[3-4]。有研究表明磷脂?；?-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路在T2DM血管病變過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]。本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性T2DM大鼠為模型，觀察黃地安消膠囊對PI3K/Akt號(hào)通路的調(diào)控作用，以期闡明黃地安消膠囊對糖尿病血管病變發(fā)揮防治作用的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級雄性GK大鼠，60只，5月齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自于上海斯萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。Wistar大鼠10只，SPF級，雄性，5月齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)符合安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.2藥品與試劑鹽酸二甲雙胍片(上海上藥信誼藥廠有限公司，生產(chǎn)批號(hào)48160302)；參芪降糖顆粒(魯南厚普制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)00115257)；黃地安消膠囊處方：葛根、生地、麥冬、枇杷葉、黃連、三七，以上所有藥材均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，并經(jīng)李立華主任中藥師鑒定，上述藥材符合2015版《中國藥典》一部，藥材和飲片項(xiàng)下的性狀鑒別標(biāo)準(zhǔn)；Nω-硝基L精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyester，L-NAME，Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)N5751-10)；Revert Aid RT Reverse Transcription Kit(美國thermo有限公司)；SYBR?Green PCR Master Mix(美國thermo有限公司)。

1.3主要儀器GA-3型血糖儀(長沙三諾生物傳感股份有限公司)，CX5PRO型全自動(dòng)生化分析儀(美國Beckman公司)，7500 FAST型Real-time PCR儀(美國ABI公司)。

1.4方法GK大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以隨機(jī)血糖>11.1 mmol·L-1作為T2DM的判斷標(biāo)準(zhǔn)[6-7]，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的GK大鼠。按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、參芪降糖顆粒組(1.08 g·kg-1)、二甲雙胍組(0.72 g·kg-1)、黃地安消膠囊高、中、低劑量組，每組10只，另取10只Wistar大鼠作為健康組。參芪降糖顆粒和二甲雙胍組成人每日給藥劑量分別為(3.00 g和2.00 g)，根據(jù)人鼠體表面積換算比例，按臨床等效劑量的4倍給藥，分別為(1.08 g·kg-1和0.72 g·kg-1)。根據(jù)黃地安消膠囊處方比例，成人每日需生藥量51 g，根據(jù)人鼠體表面積換算比例，計(jì)算得出大鼠每日所需生藥量為4.59 g·kg-1，處方浸膏得率為33%，計(jì)算得出大鼠每日所需浸膏量為1.51 g·kg-1，按臨床等效劑量的8、4、2倍，設(shè)置黃地安消膠囊高、中、低劑量組，給藥浸膏量分別為12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1和3.00 g·kg-1。除健康組外，其余各組均以濃度為0.1 g·kg-1L-NAME加入到飲用水中聯(lián)合高脂飼料飼養(yǎng)的方法進(jìn)行造模，連續(xù)6周[8-9]，健康組給予相同溶媒，并喂飼普通飼料。造模第一天按上述劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6周，健康組和模型組給予等量溶媒。

1.5檢測指標(biāo)與方法

1.5.1一般形態(tài)學(xué)觀察 觀察各組大鼠精神、活動(dòng)狀態(tài)、皮毛色澤、飲食量、體重及死亡等情況。

1.5.2空腹血糖(FBG)檢測 分別于造模第0周、2周、4周、6周，各組大鼠禁食12 h，用酒精清潔消毒尾部皮膚，采血針刺破尾靜脈血管，將尾靜脈血滴入血糖儀中，檢測其FBG。

1.5.3血清生化指標(biāo)檢測 第6周末次給藥后，禁食12 h，腹腔注射3.50%的水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h后，離心分離血清，檢測血膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HLDL)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的含量。

1.5.4腹主動(dòng)脈病理組織學(xué)檢查 分離大鼠腹主動(dòng)脈，置于10%的甲醛溶液中，采用HE染色觀察大鼠腹主動(dòng)脈病理組織學(xué)損傷程度，Masson染色觀察大鼠腹主動(dòng)脈膠原纖維變化情況，Verhoeff染色觀察大鼠腹主動(dòng)脈彈力纖維變化情況。

1.5.5腹主動(dòng)脈PI3K、PTEN、TRIB3、Akt、HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá) 取100 mg大鼠腹主動(dòng)脈組織，采用TRIzol 法抽提總RNA，42 ℃水浴1 h，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。取cDNA 2.5 μL，加入2×qPCR Mix 12.5 μL，正向逆向引物各1 μL，去離子水8 μL，總體系25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s及60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用相對定量法進(jìn)行分析，目的基因mRNA相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。各引物序列如表1所示。

表1 引物序列基因

2 結(jié)果

2.1一般形態(tài)學(xué)觀察健康組大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，毛色光亮，飲食飲水量正常；模型組大鼠行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍，毛色發(fā)黃、蓬松無光澤，飲食飲水量明顯增加，體重增加緩慢[10]；與模型組比較，黃地安消膠囊各劑量組、參芪降糖顆粒和二甲雙胍組精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛色、飲食飲水量等情況具有不同程度的改善。實(shí)驗(yàn)期間，模型組有2只大鼠死亡，其他各組大鼠無死亡。

2.2各組大鼠FBG比較與健康組相比，模型組大鼠2周、4周、6周時(shí)，血清FBG水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，黃地安消膠囊高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)4周、6周時(shí)，可顯著降低FBG水平(P<0.05或P<0.01)，黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)6周時(shí)可顯著降低FBG水平。結(jié)果見表2。

2.3血清生化指標(biāo)比較與健康組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平均明顯上升(P<0.01)，HDL-C水平顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，黃地安消膠囊高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，HDL-C水平顯著上升(P<0.05或P<0.01)；黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)僅血清ox-LDL水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他指標(biāo)如血清TC、TG、LDL-C水平雖有所下降，HDL-C水平雖有所上升，但均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

2.4腹主動(dòng)脈HE染色觀察病理損傷HE染色顯示，健康組大鼠腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞平行排列，內(nèi)膜光滑平整；模型組大鼠腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂、腫脹脫落，內(nèi)膜斷裂不平整，血管平滑肌細(xì)胞肥大，血管中膜厚度明顯增加。經(jīng)黃地安消膠囊藥物干預(yù)6周后，各組大鼠腹主動(dòng)脈病理損傷程度明顯改善，結(jié)果見圖1。

表2 黃地安消膠囊對GK大鼠FBG的影響

注：與健康組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01

2.5腹主動(dòng)脈Masson染色觀察膠原纖維變化Masson染色重點(diǎn)觀察膠原纖維變化情況，以藍(lán)色為陽性表達(dá)。健康組大鼠腹主動(dòng)脈管壁膠原纖維分布均勻，相鄰細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)完好，血管周圍有少量藍(lán)染膠原纖維，纖維化程度輕；模型組大鼠腹主動(dòng)脈膠原纖維明顯增多，粗大膠原纖維相互連接為團(tuán)塊狀，排列紊亂，分布不勻，管周纖維化明顯；與模型組比較，各給藥組膠原纖維化明顯好轉(zhuǎn)，僅黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)效果不太明顯，管周有部分藍(lán)染纖維，結(jié)果如圖2所示。

2.6腹主動(dòng)脈Verhoeff染色觀察彈力纖維變化Verhoeff染色重點(diǎn)觀察彈力纖維變化情況，以藍(lán)黑色或黑色為陽性表達(dá)。健康組大鼠腹主動(dòng)脈彈力纖維分布均勻、整齊，完整無斷裂，呈藍(lán)黑色或黑色；模型組大鼠腹主動(dòng)脈彈力纖維分布不均勻，排列紊亂、疏松，可見明顯斷裂；與模型組比較，黃地安消膠囊各劑量組大鼠腹主動(dòng)脈彈力纖維排列分布相對均勻整齊，有少量斷裂，參芪降糖組大鼠腹主動(dòng)脈彈力纖維排列均勻、整齊，斷裂不明顯；二甲雙胍組大鼠腹主動(dòng)脈彈力纖維排列欠均勻整齊，可見明顯斷裂，結(jié)果如圖3所示。

2.7腹主動(dòng)脈各指標(biāo)mRNA表達(dá)量與健康組比較，模型組大鼠腹主動(dòng)脈TRIB3、PTEN mRNA水平均顯著下降(P<0.01)，PI3K、Akt 、HIF-1α、VEGF mRNA水平明顯上升(P<0.01)。與模型組比較，黃地安消膠囊高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)腹主動(dòng)脈TRIB3、PTEN mRNA水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)，PI3K、Akt 、HIF-1α、VEGF mRNA水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)；黃地安消膠囊低劑量組(3.00 g·kg-1)雖然TRIB3、PTEN mRNA水平有所上升，PI3K、Akt、HIF-1α、VEGF mRNA有所下降，但均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。

3 討論

糖尿病在中醫(yī)中被稱為“消渴病”，主要病變部位在肺、胃、腎三處，“陰津虧耗，燥熱偏盛，進(jìn)而熱灼津虧血瘀”為其主要病機(jī)，“益氣、養(yǎng)陰、活血”為其主要治則。黃地安消膠囊由黃連、生地、三七等六味藥物組成，方中黃連清熱燥濕，生地清熱生津、涼血，三七活血化瘀，麥冬、葛根補(bǔ)陰津虧損，枇杷葉清降肺胃之氣，諸藥合用共湊清熱潤燥、養(yǎng)陰生津、活血之功效，臨床療效確切。

糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為膠原合成的增加、血管壁的逐漸增厚、彈性纖維減少、血管僵硬度增加[11]。因此，血管壁中膜的厚度，膠原、彈性纖維的含量代表了糖尿病血管病變的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，給予黃地安消膠囊干預(yù)6周后，黃地安消膠囊組大鼠腹主動(dòng)脈中膜厚度下降，膠原含量減少，彈性纖維的含量增加，說明黃地安消膠囊可有效的抑制糖尿病血管病變的發(fā)生與發(fā)展。

表3 黃地安消膠囊對GK大鼠血清生化指標(biāo)的影響

注：與健康組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

表4 各組GK大鼠PI3K、TRIB3、PTEN、PI3KP85a、Akt 、HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)

注：與健康組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病血管病變的病理基礎(chǔ)，高血脂是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的直接原因[12]。研究認(rèn)為血管病變與血液中TC、TG、LDL、HLDL、ox-LDL的含量相關(guān)，尤其與HLDL、LDL和ox-LDL的含量聯(lián)系更為密切[13-15]，治療與防止動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵在于降低TC、TG、LDL、ox-LDL的含量，升高HLDL的含量。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃地安消膠囊能顯著降低血清TC、TG、LDL和ox-LDL水平，升高HLDL水平(P<0.05或P<0.01)。

PI3K/Akt信號(hào)通路屬于磷脂酞肌醇信號(hào)通路系統(tǒng)，在機(jī)體新陳代謝、細(xì)胞生長增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16]。在T2DM的發(fā)病過程中，持續(xù)的高血糖可激活PI3K/Akt信號(hào)通路[17]，催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，誘導(dǎo)Akt活化[18]，從而促進(jìn)下游靶基因缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)[19]。HIF-1α含量的增加又可刺激VEGF的表達(dá)，從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞的異常增殖，導(dǎo)致糖尿病血管病變的發(fā)生與發(fā)展[20-21]。PTEN和TRIB3是調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的重要分子，PTEN可使PIP3去磷酸化，抑制PI3K的磷酸化作用[22]，TRIB3可與Akt結(jié)合，抑制Akt活化[23]，阻斷通路下游靶基因的活化，從而對糖尿病血管病變的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃地安消膠囊組高、中劑量組(12.00 g·kg-1、6.00 g·kg-1)大鼠腹主動(dòng)脈TRIB3、PTEN mRNA含量顯著上升(P<0.05或P<0.01)，Akt、VEGF和HIF-1α mRNA含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)，說明黃地安消膠囊通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路對T2DM血管病變發(fā)揮防治作用。

綜上，黃地安消膠囊對T2DM血管病變具有一定的防治作用，其機(jī)制調(diào)控可能與PI3K/Akt信號(hào)通路、改善糖脂代謝有關(guān)。

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