海洋放線菌酰胺酶AM合成基因的克隆

◎ 馬艷玲，李海賢，翁 萍，劉澤璇，許小慶，曾 榮

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231）

放線菌與人類的生產(chǎn)和生活息息相關(guān)，是很多天然藥物和生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源[1]。海洋放線菌產(chǎn)生了許多具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)以及特殊生理活性和生理功能的物質(zhì)[2]。盡管海洋放線菌的類群和數(shù)量都非?？捎^，但很多研究者使用經(jīng)典的分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)卻失敗了[3]。近年來(lái)，從海洋放線菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的SalinosporamideA等一系列新的活性化合物，均可證明海洋是一個(gè)具有極大地潛力的資源寶庫(kù)[4-7]。因此，本研究旨在以稀有海洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205為實(shí)驗(yàn)材料，克隆出海洋放線菌酰胺酶AM的完整基因，以為該基因簇的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來(lái)源

海洋放線菌Salinispora CNS-205分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

大腸桿菌DH10B；限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量marker；DNA聚合酶。DNA提取試劑盒，T4DNA連接酶，凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒等，均購(gòu)買自天根生化科技（北京）有限公司；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR反應(yīng)體系：H2O 28.5 μL，5×FAST HiFidelity PCR Buffer 10 μL，20×FAST PCR Enhancer 2.5 μL，DMSO 2 μL，Template 2 μL，PrimerL 2 μL，PrimerR 2 μL，F(xiàn)AST HiFidelity polymerase 1 μL。PCR 程序：升溫90 ℃，2 min；DNA變性95 ℃，30 s；退火53 ℃，30 s；延伸72 ℃，2 min；30個(gè)循環(huán)后，72 ℃維持10 min，電泳。PCR產(chǎn)物的片段為雙鏈平末端，需通過(guò)酶切的方式將黏性末端暴露出來(lái)。酶切反應(yīng)體系如下（50 μL反應(yīng)體系）：

然后放入37 ℃水浴鍋中水浴2 h，經(jīng)膠回收后的PCR產(chǎn)物連入pUC-18載體。

酶連體系（20 μL反應(yīng)體系）：

1.2.2 酶切驗(yàn)證

用EcoRI和NdeI酶切，酶切反應(yīng)體系如下（10 μL反應(yīng)體系）：

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

以海洋放線菌總DNA為模板，用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，再EcoRI和NdeI酶切回收。原PCR產(chǎn)物的目的條帶應(yīng)位于大約1 800 bp處，如圖1所示。

圖1 PCR電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證

圖2中第一個(gè)條帶約在2 700 bp左右，為載體的酶切條帶；第二個(gè)條帶位于1 800 bp左右，為目的基因的酶切條帶。得出該重組質(zhì)粒后，測(cè)序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

圖2 酶切驗(yàn)證圖

3 討論

酰胺酶的?；D(zhuǎn)移活性能催化底物生成其相對(duì)應(yīng)的異羥肟酸，異羥肟酸可作為食品添加劑、生長(zhǎng)因子、抗白血病、抗肺結(jié)核病、腫瘤抑制因子等藥物，是極為重要的可用于化學(xué)治療的物質(zhì)，具有重要的生物學(xué)活性。其金屬離子的螯合作用還可以為微生物所吸收利用，在金屬離子匱乏的環(huán)境中具有重要的意義[8]。

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