兒童抗病毒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

崔慶艷，楊懷雷，劉敏，倪淑玲，王永生※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021；2.吉林省人參研究院，長春 130117）

兒童抗病毒顆粒是以大青葉為君藥，黃芩、柴胡和金銀花為臣藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、瀉火升陽等藥效，主要用于治療兒童由于病毒性感染引發(fā)的高熱寒戰(zhàn)、咳嗽咽痛、頭痛乏力等癥狀，且療效緩和穩(wěn)定[1]。本試驗(yàn)分別通過薄層色譜（TLC）法和高效液相色譜（HPLC）法對該處方中的主要有效成分進(jìn)行定性鑒別和定量分析，進(jìn)而建立兒童抗病毒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260 HPLC（美國安捷倫公司）；FA1104天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；ZF-1手提式紫外燈（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；RE-52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6050真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 材料

兒童抗病毒顆粒（吉林大學(xué)紫元天然藥學(xué)化學(xué)研究室自制）；靛玉紅對照品110717-200204、靛藍(lán)對照品110716-201111、柴胡皂苷對照品110718-200805、黃芩素對照品 111595-201306、黃芩苷對照品110715-201318、漢黃芩素對照品111514-201304、綠原酸對照品110713-200911（中國食品藥品檢定研究院）；硅膠G板（青島海洋化工廠）；聚酰胺薄膜（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒定

2.1.1 大青葉薄層鑒定[2，3]取兒童抗病毒顆粒樣品2.0g，加入10mL甲醇和30mL乙酸乙酯作為提取溶劑，加熱回流提取30min，放冷，過濾，將濾液真空干燥至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?mL，作為供試品溶液。另取不含大青葉的顆粒采用同法制得陰性對照品溶液。分別精密稱取靛藍(lán)對照品和靛玉紅對照品適量，加入10mL三氯甲烷溶解定容即得混合對照品溶液。

分別取上述供試品溶液和陰性對照品溶液5L、對照品溶液2L，在同一硅膠板上分別點(diǎn)樣，以苯-三氯甲烷-丙酮（v∶v∶v=4∶3∶1）為展開劑展開，用吹風(fēng)機(jī)低溫小風(fēng)速吹干，在日光下觀察。結(jié)果在對照品斑點(diǎn)的相應(yīng)位置，供試品溶液也出現(xiàn)相同顏色的兩個(gè)斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾，可以定性鑒別該處方中的大青葉。

2.1.2 黃芩薄層鑒定[4]取兒童抗病毒顆粒樣品3.0g，加20mL甲醇和40mL乙酸乙酯，回流提取30min，冷卻，過濾，將濾液真空干燥至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?mL，作為供試品溶液。另取不含黃芩的顆粒采用同法制得陰性對照品溶液。分別精密稱取黃芩素對照品、黃芩苷對照品、漢黃芩素對照品適量，加入10mL甲醇溶解并定容，即得3種對照品溶液。分別取上述供試品溶液、陰性對照溶液5L，3種對照品溶液各2L，在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（v∶v∶v∶v=9∶3∶1∶2）為展開劑展開，自然狀態(tài)下晾干，在365nm紫外燈下觀察。結(jié)果供試品溶液在各對照品斑點(diǎn)的相應(yīng)位置上，分別顯示出顏色相同的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾，可以鑒別該處方中的黃芩。

2.1.3 柴胡薄層鑒定[5，6]取兒童抗病毒顆粒樣品2.0g，加入40mL甲醇超聲20min后過濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?mL，即得供試品溶液，另取不含柴胡的顆粒2.0g，同法制得陰性對照品溶液。精密稱取柴胡皂苷對照品適量，加甲醇溶解得對照品溶液。分別取以上3種溶液各5L，在同一硅膠板上點(diǎn)樣，以氯仿-乙醇-水（v∶v∶v=20∶6∶1）為展開劑展開，自然狀態(tài)下晾干，噴以含4%對甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液作為顯色劑，在60℃下加熱直至斑點(diǎn)顯現(xiàn)清晰后在365nm紫外燈下觀察。結(jié)果，供試品和對照品在硅膠板相同的位置上出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)，可以鑒別制劑中的柴胡藥材。

2.1.4 金銀花薄層鑒定[7]取兒童抗病毒顆粒樣品2.0g，加入10mL甲醇超聲提取30min，過濾即得供試品溶液。另取不含金銀花的樣品顆粒2.0g，按同法制得陰性對照品溶液。精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇配制10.05mg/mL的對照品溶液。分別取上述溶液各5L，在同一硅膠板上點(diǎn)樣，以醋酸乙酯-甲酸-水（v∶v∶v=8∶4∶1）為展開劑展開，自然狀態(tài)下晾干，在紫外燈（365nm）下觀察。結(jié)果供試品在對照品斑點(diǎn)相應(yīng)的位置顯示相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件[8]色譜柱：AgilentTC-C18柱（4.6mm×250mm，5m）；流動(dòng)相：甲醇-水（v∶v=75∶25）；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10L；檢測波長：289nm。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取靛玉紅對照品適量至10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成濃度為0.3024mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取兒童抗病毒顆粒樣品1.0g左右，加入30mL甲醇加熱回流提取3h。將提取液蒸干，殘?jiān)屑尤爰状歼m量溶解，將上述溶液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中并定容至刻度，過濾取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 取不含大青葉的組方藥材按“2.2.3”項(xiàng)下方法制得陰性對照品溶液。

2.2.5 測定 精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液各10L，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。在對照品色譜圖出峰的保留時(shí)間位置上，供試品溶液色譜圖也出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，且陰性對照品色譜圖無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 陰性樣品、靛玉紅對照品及樣品色譜圖Fig.1 Negative sample solution，Indirubin reference substance and Sample solution chromatogram

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下靛玉紅對照品溶液適量，分別加入不同體積的甲醇進(jìn)行稀釋，制得濃度分別為0.806g/mL、1.610g/mL、3.129g/mL、6.438g/mL、9.185g/mL和12.264g/mL的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。結(jié)果得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=16.38X+0.028 8，R2=0.999 9，靛玉紅在0.806g/mL～12.264g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 靛玉紅對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig2 The standard curve of Indirubin reference

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，每次進(jìn)樣20L，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果得RSD值為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批兒童抗病毒顆粒樣品6份，每份2.0g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液。另取靛玉紅對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備對照品溶液。分別精密量取上述供試品溶液和對照品溶液20L，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，RSD值為0.78%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取兒童抗病毒顆粒樣品2.0g左右，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h分別在高效液相色譜儀進(jìn)樣20L，記錄色譜峰面積，測得RSD值為1.12%，結(jié)果表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知靛玉紅含量的兒童抗病毒顆粒樣品6份，每份1.0g，加入適量的靛玉紅對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，計(jì)算得平均回收率為100.07%，RSD值為0.90%，結(jié)果表明本方法具有良好的回收率。結(jié)果見表1。

表1 靛玉紅加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tabble 1 The add sample recovery test results of the indirubin

2.2.11 樣品中靛玉紅含量測定 分別稱取不同批次的6個(gè)兒童抗病毒顆粒樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另精密稱取靛玉紅對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件制備對照品溶液。分別將上述供試品溶液和對照品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得平均含量為0.019 5%。結(jié)果見表2。根據(jù)實(shí)際裝樣情況，規(guī)定每袋兒童抗病毒顆粒中靛玉紅的含量不得低于0.5mg。

表2 6批次兒童抗病毒顆粒樣品中靛玉紅的含量測定Table 2 Indirubin determination in the 6 bathes of children antiviral particles results

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對展開系統(tǒng)條件、點(diǎn)樣量、檢視條件進(jìn)行考察，建立了兒童抗病毒顆粒中的大青葉、黃芩、柴胡的薄層色譜定性鑒別方法，分離度好，專屬性強(qiáng)，陰性對照無干擾，可以有效地鑒定組方藥材。

根據(jù)2015版《中國藥典》中靛玉紅含量測定方法的條件進(jìn)行測定，并不能很好地將靛玉紅與其他成分分離，故在此基礎(chǔ)上優(yōu)化色譜條件[9]。流動(dòng)相甲醇∶水（v∶v）為75∶25、檢測波長為289nm時(shí)，靛玉紅能完全分離且峰形較好，塔板數(shù)符合要求且保留時(shí)間適宜，故選定以上色譜條件。

本實(shí)驗(yàn)分別通過TLC法和HPLC法對兒童抗病毒顆粒進(jìn)行定性鑒別和定量分析，結(jié)果表明，本方法專屬性好、精確度高、操作簡便可行，能迅速準(zhǔn)確地對該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，故可通過本方法控制兒童抗病毒顆粒的質(zhì)量檢驗(yàn)指標(biāo)。

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