免疫基因稀有變異與精神分裂癥相關(guān)性☆

向波 楊振興 喻明蘭 趙連生 王英成 李濤◎ 王強

精神分裂癥終身患病率為1%[1]。研究發(fā)現(xiàn)該病的遺傳度高達(dá)80%[2]。雖然具有高度遺傳性，但其病理生理機制至今仍不明確。近年來，全基因組 關(guān) 聯(lián) 分 析 （genome-wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)許多單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP）與精神分裂癥易感風(fēng)險相關(guān)[3]，但它們只能解釋表型變異的小部分[4]。越來越多的證據(jù)表明，少見（最小等位基因頻率，minor allele frequency，MAF：1% ～5% ） 和 罕 見（MAF＜1%）稀有變異在復(fù)雜性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用（宏效應(yīng)），可能彌補丟失的遺傳性，如多中心大樣本的歐洲人群全基因組外顯子測序研究發(fā)現(xiàn)，特定生物通路稀有變異累積與精神分裂癥相關(guān)[5]。因此，本研究將對中國人群精神分裂癥患者和正常對照進(jìn)行全基因組外顯子測序，以探究免疫基因稀有變異累積與精神分裂癥病因?qū)W的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象患者組為四川大學(xué)華西醫(yī)院心理衛(wèi)生中心門診或住院精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①由2名精神科醫(yī)師診斷，符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊（第4版）》精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②未曾服用過任何抗精神病藥物、抗抑郁藥、苯二氮類或其他影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，即為首發(fā)精神分裂癥患者；③漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：①明確患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；②有物質(zhì)濫用史；③有嚴(yán)重過敏史。對照組為成都市以及周邊地區(qū)招募的志愿者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①無精神疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病；②無精神疾病家族史；②漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)同患者組。患者共入組94例，其中男46例，女48例；年齡（23.94±6.92）歲；受教育年限（12.79±3.15）年。對照共入組134名，其中男71名，女63名；年齡（24.39±10.95）歲；受教育年限（13.5±2.89）年。 兩組在年齡、性別和教育年限之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過四川大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。入組前所有受試者或其監(jiān)護(hù)人同意并簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 DNA獲取 抽取受試者的外周血5～10 mL，加入EDTA抗凝，苯酚—氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2 全基因組外顯子捕獲及測序 對234名受試者DNA隨機打斷，將片段化的DNA分子在酶的作用下補齊黏性末端而成為平末端，連接接頭，通過外顯子序列捕獲芯片捕獲目標(biāo)外顯子區(qū)域，然后對捕獲的目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴增，末端補平及加“A”堿基，連接測序接頭，最后應(yīng)用 Illumina Hiseq 2000進(jìn)行全外顯子測序。

1.2.3 全外顯子測序數(shù)據(jù)預(yù)處理 目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)簽拆分后獲得各個樣本的原始序列，去除測序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，運用 BWA 軟件（http://bio-bwa.sourceforge.net/）比對到參考基因組上，采用GATK軟件（https://software.broadinstitute.org/gatk/）對各個樣本的比對數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點的檢測，對單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）和插入缺失突變（insertions and deletions，Indels）等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析（主要參考dbSNP和hg19）。同時對每名受試者的測序深度、覆蓋區(qū)域等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計,并采用Wilcoxon秩和檢驗方法進(jìn)行組間比較。

1.2.4 免疫通路獲取及其統(tǒng)計分析 本研究基于Reactome（http://www.reactome.org/）數(shù)據(jù)庫獲取了5個與免疫相關(guān)的生物通路（AUTOIMMUNE_THYROID_DISEASE、TRANSLOCATION_OF_ZAP_70_TO_IMMUNOLOGICAL_SYNAPSE、INTESTINA L_IMMUNE_NETWORK_FOR_IGA_PRODUCTION、IMMUNOREGULATORY_INTERACTIONS_BETWE EN_A_LYMPHOID_AND_A_NON_LYMPHOID_CEL L和 PRIMARY_IMMUNODEFICIENCY）， 并應(yīng)用KGGseq軟件[6]對前期預(yù)處理完的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制（默認(rèn)參數(shù)），以及采用 SKAT軟件[7]中 Burden Analysis關(guān)聯(lián)分析探究稀有變異與精神分裂癥之間的關(guān)系 （主要對Gene-based和候選的5個免疫通路進(jìn)行分析）。本研究也基于gsea4 gwas-v2（http://gsea4 gwas-v2.psych.ac.cn/） 軟件探究Gene-based結(jié)果中有統(tǒng)計學(xué)意義的基因（P＜0.05）所參與的生物通路。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果外顯子富集后每名個體可以獲取大約7.6 Gb的數(shù)據(jù)納入后續(xù)分析，靶向大約34.60 Mb的外顯子區(qū)域以及側(cè)翼（flanking）區(qū)域。運用Burrows-Wheeler Aligner軟件可以將99.75%的末端配對閱讀框比對到參考基因組序列hg19。另外，為確保更高的檢測靈敏度，88.60%的靶向捕獲外顯子區(qū)域被至少10×的高質(zhì)量基因型覆蓋，并且在患者組和對照組之間，大于1×（P=0.08）和大于10×（P=0.33）測序覆蓋度差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 外顯子測序的數(shù)據(jù)匯總

2.2免疫通路稀有變異與精神分裂癥相關(guān)分析對234名受試者外顯子測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和多態(tài)性檢測，有6名受試者由于質(zhì)量偏低或污染而被排除（3名精神分裂癥患者和3名對照）。當(dāng)MAF≤1%時，Gene-based分析發(fā)現(xiàn)TYK2基因中有22個稀有變異在精神分裂癥患者中高富集（P＜0.001），同時也發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的基因參與了 2個生物通路：Disease（P=0.034）和Adaptive Immune System （P=0.021），見表 2。當(dāng)MAF≤1%時，也發(fā)現(xiàn)2個免疫通路中稀有突變在精神分裂癥中高富集：AUTOIMMUNE_THYROID_DISEASE（P=0.001）和 TRANSLOCATION_OF_ZAP_70_TO_IMMUNOLOGICAL_SYNAPSE（P=0.016），見表 3。

表2 Gene-based分析結(jié)果中有統(tǒng)計學(xué)意義基因參與的生物通路

表3 5個候選免疫通路及其分析結(jié)果

3 討論

本研究通過對精神分裂癥全基因組外顯子進(jìn)行測序，探究免疫通路中稀有變異累積與精神分裂癥發(fā)病機制之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了2個免疫通路AUTOIMMUNE_THYROID_DISEASE和TRANSLO CATION_OF_ZAP_70_TO_IMMUNOLOGICAL_SYN APSE與精神分裂癥相關(guān)。

自身免疫性甲狀腺病 （autoimmune thyroid disease，AITD）是一組以甲狀腺為靶器官的自身免疫性疾病，可影響全身多個系統(tǒng)。其發(fā)病率在7%～8%[8]。該病主要包括Graves病、Graves眼病和自身免疫性甲狀腺功能減退 （autoimmune hypothyroidism，AIH）。AITD的發(fā)病機制復(fù)雜，可能與多個因素共同作用有關(guān)，如遺傳因素、細(xì)胞因子[9]、細(xì)胞凋亡[10]以及微量元素等。已有研究顯示AITD和精神分裂癥可能存在共同的病理基礎(chǔ)，如HAMMOND等[11]發(fā)現(xiàn)小病毒B19感染大腦可能引起AITD和精神分裂癥，以及一些研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者常伴有AITD[12]。

ZAP-70是一種胞內(nèi)酪氨酸激酶，主要表達(dá)于T細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)ZAP-70缺失的患者外周血中沒有功能性T細(xì)胞，常伴有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷[13]。動物實驗也發(fā)現(xiàn)ZAP-70在CD8＋T細(xì)胞中起著重要作用[14]，并且已有研究報道CD8＋T細(xì)胞與精神分裂癥的病理機制相關(guān)[15]。ABERG等[16]對11185例精神分裂癥患者和10768名正常對照進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) TRANSLOCATION_OF_ZAP_70_TO_IMMUNOLOGICAL_SYNAPSE通路與精神分裂癥相關(guān)，也進(jìn)一步顯示出該通路中常見/稀有變異累積在精神分裂癥發(fā)病機制中起著重要的作用。

通過Gene-based分析，本研究發(fā)現(xiàn)P值最小的基因TYK2，該基因編碼一種TYK2激酶，該激酶是JAK家族成員之一[17]。已有研究報道該基因與神經(jīng)元[18]、細(xì)胞因子[19]以及精神分裂癥[20]相關(guān)。DEBNATH等[21]的研究也報道了適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（adaptive immune system）與精神分裂癥病理機制相關(guān)。

雖然本研究采用全基因組外顯子測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)免疫通路與精神分裂癥相關(guān)，但也存在一些不足：首先，沒有得到全基因組效能的基因，最主要的原因是樣本量偏小，需要在后續(xù)的研究中擴大樣本量進(jìn)一步驗證；其次，缺少不同種族人群獨立樣本的驗證。

綜上所述，本研究基于全基因組外顯子測序和生物通路分析方法，發(fā)現(xiàn)2個免疫通路與精神分裂癥病理生理機制相關(guān)，同時也需要在后續(xù)的大樣本研究中進(jìn)一步驗證該結(jié)果，為精神分裂癥的分子機制研究提供理論基礎(chǔ)。

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