首發(fā)精神分裂癥DNMT1基因多態(tài)性與認(rèn)知功能關(guān)系☆

翟金國 苗慶山 高燕 陳敏 周亞楠 魏欽令 李君

精神分裂癥可能是多基因遺傳的疾病，全基因組掃描發(fā)現(xiàn)100多個(gè)DNA位點(diǎn)可能與精神分裂癥有關(guān)[1]，然而，傳統(tǒng)遺傳學(xué)研究并沒有突破性進(jìn)展[2]。表觀遺傳學(xué)認(rèn)為精神分裂癥是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[3]。DNA甲基化（DNA methylation）是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的表觀遺傳修飾途徑，對正常發(fā)育至關(guān)重要[4]。DNA甲基化由3個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 （DNA methyctransferace，DNMT）完成，其中DNMT1在人類細(xì)胞中最豐富[5]。SARADALEKSHMI等[6]研究認(rèn)為，DNMT基因多態(tài)性可能與精神分裂癥表觀遺傳易感性有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1甲基化變異可能增加早發(fā)精神分裂癥的患病風(fēng)險(xiǎn)[7]。DNA甲基化對個(gè)體正常發(fā)育，尤其是神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要，而精神分裂癥的神經(jīng)發(fā)育假說越來越受到重視，其認(rèn)知功能、陰性癥狀都可能與神經(jīng)發(fā)育異常有關(guān)。由此提出：DNMT是否會影響精神分裂癥患者的認(rèn)知功能呢？目前鮮有文獻(xiàn)對此進(jìn)行研究。因此，本研究將探討DNMT1基因多態(tài)性是否影響首發(fā)、未用藥精神分裂癥患者的認(rèn)知功能。

1 對象與方法

1.1 研究對象精神分裂癥組來自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2015年6月至2017年6月的精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次發(fā)病，病程≤2年，未使用精神藥物，半年內(nèi)未曾接受過電抽搐治療；③18～40歲；④受教育時(shí)間≥6年，理解知情同意書內(nèi)容；⑤漢族，男女不限，右利手；⑥視力或矯正視力正常；⑦陽性和陰性癥狀量表（positive and negative symptom scale，PANSS）總分≥70 分，以下4個(gè)條目至少有1個(gè)條目超過4分：P1-妄想，P2-概念紊亂，P3-幻覺行為，P6-猜疑/被害；⑧能夠合作完成認(rèn)知功能的評定。排除標(biāo)準(zhǔn)[8]：①有腦外傷、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他重大軀體疾病史；②有酒精或其他藥物濫用或依賴史，或目前存在藥物濫用；③目前患有其他任何精神疾病或可能影響認(rèn)知功能的其他疾?。虎苤橇φ系K，認(rèn)知功能測試不能完成者；⑤有自殺或傷害他人的危險(xiǎn)；⑥妊娠或哺乳期婦女。

對照組招募自濟(jì)寧市某高校、醫(yī)院和企業(yè)。入組標(biāo)準(zhǔn)：①無任何現(xiàn)患精神疾病或精神疾病史；②18～40歲；③教育時(shí)間≥6年，理解知情同意書內(nèi)容；④漢族，男女不限，右利手；⑤視力或矯正視力正常。排除標(biāo)準(zhǔn)同精神分裂癥組。

納入精神分裂癥患者186例，男98例，女88例 ，年 齡 （30.62±7.63） 歲 ，受 教 育 時(shí) 間 （11.41±2.42）年，發(fā)病年齡（23.76±5.48）歲，病程（1.22±0.82）年，PANSS 得分（72.54±18.62），精神障礙家族史陽性率27.96%。對照組共納入182名健康對照，男性 95 名，女性 87 名，年齡（29.84±6.86）歲，受教育時(shí)間為（13.64±3.25）年，精神障礙家族史陽性率9.89%。精神分裂癥組與對照組性別、年齡、受教育時(shí)間、職業(yè)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而兩組間精神障礙家族史陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

本研究經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院和濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。全部研究對象均簽署書面知情同意書。

1.2 臨床評定

1.2.1 臨床病理癥狀評定 在基線采用PANSS評估患者的臨床病理癥狀，同時(shí)收集兩組被試性別、年齡、職業(yè)、民族、家族史等社會人口學(xué)資料。

1.2.2 認(rèn)知功能評定 采用MATRICS成套共識認(rèn)知功能評定工具[MATRICS（the measurement and treatment research to improve cognition in schizophrenia） consensus cognitive battery，MCCB]中文版對所有被試進(jìn)行認(rèn)知功能評價(jià)[9]。該測試共7個(gè)維度，包括信息處理速度、注意/警惕性、工作記憶、語言學(xué)習(xí)、視覺學(xué)習(xí)、推理、問題解決和社會認(rèn)知。每個(gè)維度選取1個(gè)分測驗(yàn)進(jìn)行評估：①信息處理速度，選擇連線測驗(yàn)A部分（trailmaking test,part A）；②注意/警惕性，選擇持續(xù)操作測驗(yàn)（continuous performance test，CPT），結(jié)果取 CPT1、CPT2和CPT3的平均值；③工作記憶，選擇空間廣度測驗(yàn)（spatial span test，SST）；④言語學(xué)習(xí)，選擇霍普金斯言語學(xué)習(xí)測驗(yàn)修正版（Hopkins verbal learning test-revised，HVLT-R）；⑤視覺記憶，選擇簡易視覺空間記憶測驗(yàn)修訂版 （brief visuospatialmemory test-revised，BVMT-R）；⑥推理、問題解決，選擇迷宮測驗(yàn)（mazes test，MT）；⑦社會認(rèn)知，選擇情緒管理測驗(yàn)（emotionmanagement test，EMT）。

所有參與研究的人員均具有中級及以上職稱，經(jīng)過課題組統(tǒng)一培訓(xùn)，培訓(xùn)內(nèi)容包括研究方案、PANSS和認(rèn)知功能評定工具M(jìn)CCB使用。5名研究者對10例患者進(jìn)行PANSS評定的一致性良好（ICC=0.95），MCCB培訓(xùn)采用北京大學(xué)于欣主編的《MCCB 中國常模手冊》[9]。

1.3 SNP選擇與基因檢測于早晨6:00-7:00抽取被試者肘靜脈血10 mL，12 g/L依地酸抗凝，常規(guī)酚氯仿法提取基因組DNA，置于-70℃條件下保存?zhèn)溆谩２捎镁酆厦告湻磻?yīng)（PCR）技術(shù)對基因多態(tài)性進(jìn)行分析[8]。根據(jù)功能意義、最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF） 和 標(biāo) 簽 狀 態(tài) 選 擇SNPs。中國漢族人群基因型數(shù)據(jù)及其上、下游區(qū)域約2 kb的序列從HapMap下載，因?yàn)镸AF＞5%，呈連鎖不平衡 （r2=0.86），所以選取rs2114724和rs2228611兩個(gè)SNPs。rs2114724多態(tài)性上游引物：5′-GGTCTCCAGTCTTCACTCTGGTCCC-3′，下游引物 ：5′-GCCGCATCCTTACCTCTGTCCCAGC-3′；rs2228611多態(tài)性上游引物：5′-CAAAACCAATCTATGATGATGACCC-3′， 下 游 引 物 ：5′-TCTCTTGAAGGTAAGGAATAGTCCG-3′。 PCR 循環(huán)條件為96℃預(yù)變性5 min，繼之以96℃變性45 s，54℃退火 45 s，72℃延伸 45 s， 進(jìn)行 36個(gè)循環(huán)，出循環(huán)后72℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物為 222 bp，取其中的 3 pL，加入 BsuRI內(nèi)切酶5 U，置于37℃溫育箱內(nèi)酶切過夜，然后通過4%瓊脂糖水平凝膠電泳分離鑒定基因型。電泳后，經(jīng)Gel Doc2000成像系統(tǒng)成相并讀取基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用Plink軟件，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用SPSS 19.0完成其他統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間年齡、受教育時(shí)間等比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，性別分布、基因型和等位基因分布情況比較采用χ2檢驗(yàn)，不同基因型患者認(rèn)知功能比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-W einberg平衡檢驗(yàn)精神分裂癥組和對照組 rs2114724（χ2=0.534，P=0.554）和 rs2228611（χ2=0.648，P=0.456）多態(tài)性位點(diǎn)的基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 rs2114724的基因多態(tài)性精神分裂癥組和對照組 SNP rs2114724的 T/T、T/C、C/C基因型分布以及T、C等位基因分布組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 1。

2.3 rs2228611的基因多態(tài)性精神分裂癥組和對照組SNP rs2228611的G/G、G/A、A/A基因型分布以及G、A等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 1。

2.4 rs2114724不同基因型患者認(rèn)知功能T/T、T/C和C/C基因型精神分裂癥患者之間認(rèn)知功能評定成 績 比 較 ，TMT-A、CPT、HVLT-R、BVMT-R、MT和EMT得分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SST成績差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.892，P=0.037），經(jīng)兩兩比較，具有C/C基因型精神分裂癥患者的SST 成績優(yōu)于 T/T（P=0.018）和 T/C（P=0.022）基因型的患者，T/T和T/C基因型患者SST成績差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.675）。見表2。

表1 精神分裂癥組和對照組DNMT1基因SNP rs2114724和SNP rs2228611基因多態(tài)性

表2 精神分裂癥組DNMT1基因SNP rs2114724不同基因型患者認(rèn)知功能評分

表3 精神分裂癥組DNMT1基因SNP rs2228611不同基因型患者認(rèn)知功能評分

3 討論

目前越來越多的證據(jù)表明，遺傳和環(huán)境因素相互作用共同導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生[10-11]。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)過程，該過程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）起關(guān)鍵作用。DNMTs家族成員中，DNMT1的功能主要是在細(xì)胞分裂中維持甲基化狀態(tài)[5]。DNMT1基因多態(tài)性可能影響基因表達(dá)，導(dǎo)致不同的臨床癥狀和各種精神疾病[12]。

SARADALEKSHMI等[6]發(fā)現(xiàn)DNMT1基因多態(tài)性可能是精神分裂癥發(fā)病的重要表觀遺傳學(xué)因素，南印度人DNMT1的SNPrs2114724和rs2228611基因型和等位基因分布與精神分裂癥顯著相關(guān)[6]。與SARADALEKSHMI等[6]的研究結(jié)果不同，本研究結(jié)果顯示，DNMT1的兩個(gè)SNPrs2114724和rs2228611的基因型和等位基因分布，在精神分裂癥組和對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即提示rs2114724和rs2228611的多態(tài)性與首發(fā)未用藥精神分裂癥不存在相關(guān)性。出現(xiàn)這種不同的結(jié)果，可能系由種族差異造成，也可能與本研究樣本量偏小等因素有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)具有C/C基因型精神分裂癥患者的SST成績顯著優(yōu)于T/T和T/C基因型患者。不同的基因型可能決定或影響特定的表型，其中包括臨床癥狀、認(rèn)知功能。既往研究探索DNA甲基化與認(rèn)知功能損害的關(guān)系已取得一定進(jìn)展：HU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0～2個(gè)月大鼠海馬DNA甲基化改變，導(dǎo)致認(rèn)知功能損害，包括工作記憶損害；另有GRINAN-FERRE等[14]針對阿爾茨海默病5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行認(rèn)知功能損害表觀遺傳機(jī)制的研究，在DNMTs家族中發(fā)現(xiàn)較高的CpG甲基化和轉(zhuǎn)錄改變，年輕小鼠DNMT1水平增加，并與認(rèn)知水平改變相關(guān)；FENG等[15]的人體研究認(rèn)為，在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)，DNMT1通過維持DNA甲基化，調(diào)節(jié)神經(jīng)元基因表達(dá)等交互作用，維持突觸的可塑性，為學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知過程所必需。由此可見，DNA甲基化可能與認(rèn)知功能有關(guān)。這些結(jié)果更支持DNA甲基化過程異?？赡軐?dǎo)致認(rèn)知功能損害。

目前在中國對DNMT1的研究主要集中在腫瘤方面，很少涉及精神分裂癥患者DNMT1和認(rèn)知功能之間的關(guān)系，本研究對首發(fā)、未治精神分裂癥患者開展rs2114724和rs2228611多態(tài)性與認(rèn)知功能之間關(guān)系研究，僅發(fā)現(xiàn)SNP rs2114724為C/C基因型的精神分裂癥患者SST成績顯著優(yōu)于T/T和T/C基因型的患者，這種差異的原因目前尚難以解釋清楚，有待進(jìn)一步研究。但本研究樣本量較小，得到的陰性結(jié)果可能存在偏倚。本研究結(jié)果雖然未充分證實(shí)DNMT1基因多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)系，但是，在一定程度上說明DNMT1基因有可能與認(rèn)知功能中工作記憶相關(guān)。希望本研究能夠引起大家對相關(guān)基因的研究興趣，進(jìn)一步探討DNMT1基因多態(tài)性與精神分裂癥及其認(rèn)知功能之間的復(fù)雜關(guān)系。

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