野生獼猴桃SOD及多糖的分離純化工藝研究

薛剛，王瑩，劉鳳霞，何際芳，沈大戰(zhàn)，卞顯玲

（1.南陽理工學院生物與化學工程學院，河南南陽473000；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室，河南南陽473000）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的金屬酶。其廣泛存在于生物體內(nèi)，能清除生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基（O2-·），維持機體中自由基產(chǎn)生和清除動態(tài)平衡的一種金屬酶[1-3]。作為生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的清潔劑，SOD在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨特的功能，在醫(yī)學、食品、化妝品等領域得到越來越多的應用。目前國內(nèi)提取SOD的來源主要有動物血液、植物和微生物[4]。SOD的提取方法有超聲波破碎浸提法、熱變性方法、等電點沉淀法、有機溶劑分級分離法等方法[5-10]。

本文研究從野生獼猴桃中分離獲得高活性的SOD，并獲得多糖產(chǎn)品，不僅實現(xiàn)了高附加值產(chǎn)品的純化，同時也實現(xiàn)了野生獼猴桃資源的綜合利用，為企業(yè)生產(chǎn)SOD及多糖產(chǎn)品提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原材料野生獼猴桃采自河南省南陽市西峽縣。

3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylicacid，DNS）、三羥甲基氨基甲烷、焦性沒食子酸、乙酸鉛、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

FD-1C-80多歧管冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TGL-16gR高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；752N紫外可見分光光度計：上海精科實業(yè)有限公司。

1.2 獼猴桃SOD的分離純化工藝探究

1.2.1 Tris-HCl緩沖液pH值對酶活性檢測結(jié)果的影響

使用不同pH值的Tris-HCl緩沖液檢測標準酶（酶活為3 000 U/mg和6 000 U/mg），使用相同的方法測定其活力，然后選出最佳pH值的緩沖液。

使用上述購買的酶活為3 000 U/mg和6 000 U/mg的SOD產(chǎn)品，在上述選擇的最佳pH值條件下進行檢測其活性，進一步對選擇的測定條件進行驗證。

1.2.2 浸提液對SOD酶活性的影響

在相同的條件下選用氯化鈉緩沖液和磷酸緩沖液進行試驗，然后測定其活性選出最佳的緩沖液。

1.2.3 有機溶劑體系的選擇

1.2.3.1 乙醇-氯仿體系混合比例的選擇

在最佳的工藝條件下和加量下用 5 ∶3、5 ∶4、5 ∶5、5∶6（體積比）的不同的乙醇-氯仿體系混合進行試驗，測其酶活力，選擇出最佳的乙醇-氯仿體系混合比例。

1.2.3.2 乙醇-氯仿體系混合體系的加量選擇

在以上最佳的工藝條件下以獼猴桃清液體積的30%、40%、50%添加氯仿-乙醇體系混合液，測其酶活，選擇出最佳添加比例。

1.2.4 SOD酶活性的測定

SOD酶活力單位定義：每毫克酶在設定條件下，抑制連苯三酚自氧化速度50%時的量為SOD的一個活力單位。

連苯三酚自氧化速率測定體系見表1。

表1 連苯三酚自氧化速率測定體系Table 1 The assay system for the self-oxidation rate of pyrogallol

在試管中按表1加入各種試劑，于25℃保溫20min后加入預熱的連苯三酚（對照管用10 mmol/L HCl代替），迅速搖勻倒入1 cm比色杯，在325 nm波長條件下，每隔30 s測定吸光值1次，要求自氧化速率控制在0.07/min。測量酶活性按表2加入。

表2 樣品SOD活力測定體系Table 2 The assay system for the activity of SOD sample

本次試驗SOD產(chǎn)品的酶活力計算公式如下：

式中：U為單位體積活力，U/mg；ν1為樣液速率，min；V1為反應液總體積，mL；V2為酶液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3 獼猴桃多糖的分離純化工藝探究

1.3.1 樣品中還原糖和總糖的測定

1）樣品中還原糖的提?。悍Q取3 g獼猴桃多糖粗品，50 mL的蒸餾水溶解，攪拌，于50℃的恒溫水浴鍋中保溫20min，用蒸餾水洗滌燒杯2次～3次后定容到100 mL，以此作為還原糖待測液。

2）樣品中總糖的水解和提取：稱取1 g粗品獼猴桃多糖，放于100 mL的小燒杯中，并向其中加入10 mL 6 mol/L HCl和15 mL蒸餾水，然后將其放入在沸水浴中進行保溫30min后倒入100 mL容量瓶中進行定容，混勻。然后吸取10 mL已經(jīng)定容過的水解液，移入到另一個100 mL的容量瓶中，然后用蒸餾水定容，用于作為總糖的待測液。

3）顯色和比色：取4支具有25 mL刻度具性試管并分別將其將其以此編號，按表3所示的量向試管中精確的加入待測液和試劑。還原糖和總糖的測定體系見表3。

表3 還原糖和總糖的測定體系Table 3 The measurement system of raw sugar and total sugar

按照上述依次加入試劑后，其余的試驗操作均按照與制作葡萄糖標準曲線時的加量完全相同，并依次測定各試管中的溶液的吸光值。

4）葡萄糖標準曲線的制作：取7支試管，并編號，依次精確加入濃度為1 mg/mL的葡萄糖標液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水補充體積至 2.0 mL 后，均加入3，5－二硝基水楊酸試劑1.5 mL。將各管搖勻后，在沸水浴中加熱5min后，取出立即放入盛有冷水的燒杯中并冷卻至室溫，再用蒸餾水定容至25 mL刻度處，并充分搖勻，測定在540 nm波長下的吸光值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，得到葡萄糖含量與吸光值之間的線性關系方程。按照下式2、式3和式4分別計算出樣品總糖、還原糖和多糖的含量。

式中：X1為還原糖含量，%；X0為總糖含量，%；X2為多糖含量，%；m0為樣品質(zhì)量，mg；m1為經(jīng)擬合標準曲線方程計算得到的還原糖質(zhì)量，mg；V0為提取液總體積，mL；V1為測定時取樣體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.2 幾種獼猴桃多糖提取工藝的比較

分別選用乙醇－氯仿混合體系和乙酸鉛和亞鐵氰化鉀混合液除雜提取多糖，其工藝流程圖如圖1、圖2所示。

圖1 乙醇-氯仿混合體系除雜提取多糖工藝流程Fig.1 The technological process of polysaccharide extraction by ethanol-chloroform hybrid system

圖2 乙酸鉛和亞鐵氰化鉀混合液提取多糖工藝流程Fig.2 The technological process of polysaccharide extraction by lead acetate and potassium ferricyanide mixture

2 結(jié)果與分析

2.1 Tris－HCl緩沖液pH值對酶活性檢測結(jié)果的影響

使用不同pH值的Tris－HCl緩沖液檢測標準酶（酶活為3 000 U/mg和6 000 U/mg），檢測結(jié)果如表4。

表4 不同pH值緩沖液處理所得酶的活性檢測結(jié)果Table 4 The activity test results of the enzyme with different pH buffer

結(jié)果顯示出不同pH值的緩沖液，SOD酶活性檢測結(jié)果是不一樣的。資料顯示[11]使用連苯三酚法檢測SOD酶的活性最佳緩沖液pH值為8.2，而本次試驗顯示，最佳 pH 值為8.6。

2.2 獼猴桃SOD的分離純化工藝探究

2.2.1 浸提液對SOD酶活性的選擇

此次試驗用pH7.8的氯化鈉緩沖液和pH7.8的磷酸緩沖液作為對照，來確定出最佳的緩沖液。浸提液對SOD酶活的影響結(jié)果見表5。

表5 提取液對SOD酶活性的影響Table 5 The effect of extracting solution on SOD enzyme activity

從表5可以看出，兩種不同的緩沖液提取出的SOD酶活性差異不太顯著。由于磷酸緩沖液浸提過的獼猴桃液只可作為廢水處理，而氯化鈉緩沖液浸提過的獼猴桃液通過濃縮后可再次加工做成獼猴桃飲料，因此從經(jīng)濟和節(jié)約的角度來看，應選用pH值為7.8的氯化鈉緩沖液作為本次試驗的浸提液。

2.2.2 有機溶劑體系的選擇

2.2.2.1 乙醇-氯仿體系混合比例的選擇

乙醇-氯仿按照 5∶3、5∶4、5∶5、5∶6體積比例混合，以獼猴桃清液體積的30%添加。乙醇-氯仿對SOD酶活性的影響如表6。

表6 不同比例的乙醇-氯仿混合體系對SOD酶活性的影響Table 6 The influence of different proportion of ethanolchloroform mixed system on SOD enzyme activity

從表6可以看出，當氯仿-乙醇體積比例為5∶3時SOD的酶活最高，所以試驗過程中選取5∶3的比例進行蛋白除雜。

2.2.2.2 乙醇-氯仿體系加量的選擇

氯仿-乙醇按照3∶5體積比混合，以獼猴桃清液體積的30%、40%、50%添加。乙醇-氯仿的量對SOD酶活性的影響結(jié)果如表7。

表7 氯仿-乙醇混合體系對SOD酶活性的影響Table 7 The effect of chloroform-ethanol mixed system on SOD enzyme activity

從表7以可以看出，不同量的氯仿-乙醇對產(chǎn)品活性影響相差很大。當氯仿-乙醇的加入量為30%的時候產(chǎn)品的活性最高，因為氯仿和乙醇結(jié)合，不僅可以萃取出溶液中的雜蛋白達到除雜效果，而且可以提取出更高活性的SOD，所以試驗過程中應該選擇氯仿-乙醇的加入量為清液的30%。

2.2.3 一次丙酮處理與二次丙酮處理的對比試驗

經(jīng)過多次試驗證明，在第一次0.6倍的丙酮沉淀出少量的產(chǎn)品和雜蛋白，其中仍含有大量的SOD，經(jīng)過第二次處理，再次加入1.2倍的丙酮沉淀出的產(chǎn)品，其酶活性大大增加，并且提高了產(chǎn)品質(zhì)量。從野生獼猴桃中提取的SOD一次處理和二次處理酶活性如表8。

表8 一次處理和二次處理的酶活性Table 8 The enzyme activity of one and two Acetone treatment

由表8得出，一次處理和二次處理之間存在明顯的差異，且二次處理結(jié)果明顯優(yōu)于一次處理，可以從粗酶中精制出酶活性更高的SOD。

綜上，最終確定野生獼猴桃SOD的提取工藝流程如圖3所示。

圖3 野生獼猴桃SOD提取工藝流程Fig.3 The extraction process flow chart of wild kiwifruit SOD

2.3 獼猴桃多糖的分離純化工藝探究

用DNS法測定多糖分別測定總糖和還原糖的吸光值，得到葡萄糖含量與吸光值之間的線性關系方程為y=3.45x-0.01，R2=0.998。根據(jù)公式計算出樣品中多糖的含量，其計算結(jié)果見表9。

表9 多糖含量測定結(jié)果Table 9 Determination of polysaccharide content

由上述試驗結(jié)果可以看出，除雜后的多糖含量明顯增加，氯仿-乙醇=3∶5（體積比）的混合體系除雜后，多糖的含量增加2.8倍，用乙酸鉛和亞鐵氰化鉀的混合溶液除雜后多糖含量增加3.2倍。由此可見除雜能夠明顯提高多糖的含量。

3 結(jié)論

本次試驗得出的最佳工藝為：選擇氯化鈉緩沖溶液為本次試驗的浸提液，最佳的Tris-HCl緩沖液的pH值為8.6，氯仿-乙醇按照3∶5體積比例混合時其酶活最高，而其加量選為獼猴桃清液體積的30%，經(jīng)過丙酮除雜后明顯可以進一步提高SOD的活力，最終可得提取得到純化的SOD的酶活力為1 500 U/mg。多糖的最佳工藝為：最佳的除雜劑為乙酸鉛和亞鐵氰化鉀的混合溶液，最終測得的多糖的含量為13.35%。

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