不同水解度的大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)與功能性關(guān)系探究

劉汝萃，曲玲玲，牛祥臣，李順秀，李成輝，劉軍

（山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東德州251200）

近年來，隨著大豆蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的不斷研究，以及對(duì)其營養(yǎng)功能的深入了解，為滿足人們不斷提高生活水平的需求，合理開發(fā)優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，已經(jīng)成為當(dāng)今的熱點(diǎn)話題。

通過酶法改性使得蛋白質(zhì)大分子水解成較小分子，改變其功能特性，過程中水解度對(duì)其功能特性起著主要影響[1]，且酶法改性具有改性條件溫和，副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛利用[2]。蛋白的酶法改性過程中水解度是一個(gè)關(guān)鍵性因素，一定程度的酶解能夠改變蛋白分子的大小、構(gòu)象及分子間/內(nèi)作用力，從而增強(qiáng)其功能性[3-4]。但酶解過度又會(huì)造成一些功能性質(zhì)的喪失，因此蛋白酶解程度的控制對(duì)于獲得具有良好功能性質(zhì)的蛋白制品起到至關(guān)重要的作用[5]。蛋白質(zhì)的持水性、粘度等在食品行業(yè)的生產(chǎn)過程中發(fā)揮著重要的作用，尤其是對(duì)奶油，甜食，糕點(diǎn)的生產(chǎn)中有良好的應(yīng)用[6-8]。

因此本試驗(yàn)研究了不同水解度（hydrolyzing degree，DH）下的大豆分離蛋白（soybean protein isolated，SPI）的結(jié)構(gòu)、粘度、溶解性和持水性變化，同時(shí)首次在大豆蛋白的分析中利用快速粘度分析儀（rapid viscosity analyzer，RVA）特征譜進(jìn)行分析，了解蛋白功能性質(zhì)和DH間的相關(guān)性，且探究不同DH下的SPI的結(jié)構(gòu)與其功能性質(zhì)間關(guān)系，旨在為今后SPI能夠更好的應(yīng)用于食品行業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（2.4AU，保存于-4℃）：諾維信生物技術(shù)有限公司。其它試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LG10-2.4A高速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)廠；FA25高剪切分散乳化機(jī)：FLUKO儀器有限公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；ML 1502E電子分析天平：梅特勒-托利多有限公司；PHSJ-4F pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器；4500 RVA快速粘度測(cè)定儀：波通瑞華科學(xué)儀器；LPG-5高速離心式噴霧干燥機(jī)：江蘇先鋒有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 pH-stat法測(cè)定SPI的DH

參考姚玉靜的方法[9]，略有改動(dòng)。稱取一定量SPI，配制成5%的溶液，攪拌至底物均勻分散于水中，水浴溫度55℃，pH調(diào)到10，按10%的質(zhì)量比添加堿性蛋白酶，反應(yīng)過程中及時(shí)加入1 mol/L的NaOH，使系統(tǒng)保持在pH為10，酶解400min，按公式（1）計(jì)算SPI的DH，并繪制水解度曲線。

式中：B為消耗堿量，mL；N為堿的摩爾濃度，mol/mL；α為氨基的平均解離度；pH為10、溫度為55℃時(shí)，α=0.44；m 為被酶解蛋白的質(zhì)量，g；h為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，大豆分離蛋白h=8.38（mmol/g蛋白質(zhì)）。

1.3.2 不同DH的SPI樣品制備

將一定量SPI樣品，配置5%的底物濃度的蛋白液，攪拌至均勻分散于水中，水浴溫度55℃，調(diào)節(jié)pH為10，按0.1%的比例添加堿性蛋白酶，反應(yīng)過程中及時(shí)加入1 mol/L的NaOH溶液，使體系pH值保持在10，酶解不同的時(shí)間，噴霧干燥酶解液即得不同酶解程度的SPI樣品。

1.3.3 SDS-PAGE電泳測(cè)定方法

SDS-PAGE不連續(xù)電泳各部分凝膠的配制見表1。

將配好濃縮膠平穩(wěn)加入距玻璃板上部邊緣5 mm處，快速插進(jìn)樣梳，靜置40min，拔出樣梳。樣品和marker變性經(jīng)100℃水浴5min，上樣。連接電極，調(diào)節(jié)電壓（濃縮膠時(shí)電壓為80 V，等到溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后加壓到120 V）。將緩沖液加到電泳槽里，連接好電源，開始電泳，先將電流調(diào)到10 mA，然后進(jìn)入分離膠后調(diào)至20 mA，待溴酚藍(lán)距離膠片邊緣約5 mm時(shí)，關(guān)閉電泳儀。電泳結(jié)束后，小刀沾水撬開未放梳子端的玻璃板，取出膠片放入固定液中，固定30min后，對(duì)固定液進(jìn)行回收，加入染色液染色12 h左右，再用脫色液脫色，用水平搖床脫色，直到膠片上條帶清晰[10]。

表1 SDS-PAGE不連續(xù)電泳各部分凝膠的配制Table 1 Gel formulation of SDS-PAGE electrophoresis

1.3.4 持水性測(cè)定

稱取10 gSPI樣品于燒杯中，先加入20 g蒸餾水，混合攪拌直到產(chǎn)品完全溶于水中。然后傾斜/翻倒燒杯，觀察溶液的反應(yīng)是類似膏狀還是液體，溶液的反應(yīng)應(yīng)該像液體一樣，類似薄煎餅的糊狀，順著杯子的一側(cè)滑下來。如果溶液不流動(dòng)，則需要持續(xù)加水并攪拌，直到溶液可以滑動(dòng)下來。如樣品較稠，則需要加蒸餾水（1 g/次）直到溶液可以被倒出來，調(diào)整后記錄共添加蒸餾水的質(zhì)量，根據(jù)公式（2）計(jì)算持水性。

1.3.5 溶解性測(cè)定

參照Qi[11]的方法，稍有改動(dòng)。配制2%的蛋白溶液，之后進(jìn)行磁力攪拌1 h，再4 500 r/min離心10min，采用凱氏定氮法（N×6.25）[12]測(cè)定上清液中的氮含量。根據(jù)公式（3）計(jì)算蛋白樣品的溶解性。

1.3.6 RVA 粘度測(cè)定

將制備得到的不同DH的SPI樣品進(jìn)行粘度測(cè)定，稱取10 g樣品，按照1：3（質(zhì)量比）的比例加入蒸餾水制得蛋白乳狀物?；旌嫌赗VA樣品缽中，攪拌均勻。測(cè)定程序如下：樣品放入粘度計(jì)中速率以160 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，每份樣品在50℃下保持1min，然后于8min內(nèi)線性加熱到95℃，并持續(xù)4min。然后冷卻到50℃，持續(xù)3min，整個(gè)過程為22min。用RVA配套軟件獲得RVA曲線并進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007軟件和SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、繪圖，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析。除非另有說明，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，并且結(jié)果表示為重復(fù)分析的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）和最小顯著差異（Least－Significant Difference，LSD）試驗(yàn)。顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI的 DH 分析

pH－stat法測(cè)定SPI不同酶解時(shí)間下的DH情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同水解時(shí)間下DH曲線圖Fig.1 The graph of hydrolysis under different hydrolysis time

由圖1得出，采用堿性蛋白酶酶解SPI，在60min內(nèi)時(shí)酶解顯著性增加（P＜0.05），在酶解 60min 時(shí) SPI的 DH 為（21.1±0.5）%。在 60min～80min 之后，隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長，SPI的DH的增長速度趨緩，最終DH 達(dá)到（22.80±0.6）%。根據(jù)水解時(shí)間與 DH 的變化曲線，選擇0～60min作為制備酶解SPI的酶解時(shí)間進(jìn)行以下試驗(yàn)。堿性蛋白酶酶解 0、10、20、30、40、50、60min，制得 SPI的 DH 分別為0%、5.4%、8.1%、11.0%、14.5%、17.9%、21.1%。

2.2 不同DH的SPI的SDS－PAGE凝膠電泳分析

對(duì)不同DH的SPI進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。

由圖2的不同酶解時(shí)間下的SDS－PAGE電泳圖可以看出，SPI水解后，隨著DH的升高（圖由左至右），A亞基和B亞基附近的低分子蛋白條帶逐漸減少。趙謀明等[13]研究表明，使用堿性蛋白酶酶解時(shí)，酶解主要作用在7S和11S的酸性亞基上。圖2中DH在21.1%時(shí)的條帶上看，7S和11S的酸性亞基已經(jīng)一部分被降解。通常來說，堿性蛋白酶酶解對(duì)堿性亞基作用較弱，依然有堿性亞基存在。水解度的升高，使得分子量逐漸減小，進(jìn)而使溶液粘度下降，從而有利于蛋白的起泡性[14]。而隨著酶解時(shí)間的延長，7S亞基條帶變化并不是特別明顯，說明堿性蛋白酶對(duì)7S敏感性較低。

圖2 不同DH的SPI的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 The SDS-PAGE electrophoresis of soy separated protein with different hydrolysis

2.3 不同DH的SPI的持水性分析

在食品加工和保藏過程中，蛋白質(zhì)的持水能力比其結(jié)合水的能力更為重要，持水能力是指蛋白質(zhì)吸水并將水分保留在蛋白質(zhì)組織中的能力，蛋白質(zhì)的持水能力與結(jié)合水的能力正相關(guān)，蛋白質(zhì)截留水的能力與絞肉制品的多汁性和嫩度有關(guān)，也與焙烤食品和其他凝膠類食品的質(zhì)構(gòu)相關(guān)，適當(dāng)?shù)倪x擇持水性在食品的加工中起到重要的意義[15]。

對(duì)不同DH的SPI的進(jìn)行持水性分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同DH的SPI的持水性圖Fig.3 The Water-holding graph of soy separated protein with different hydrolysis

由圖3得出，不同DH的SPI的持水性隨著水解度的增大而顯著性降低（P＜0.05），在 DH 為21.1%時(shí)，最終持水性由 2.85降低至 2.2。劉宏芳等[16]認(rèn)為酶解修飾處理明顯地降低了持水性，這可能是由于所用的SPI是商品化產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程中通過某些處理使得保水性最大化，因此，酶解修飾處理反而降低它的持水性。從試驗(yàn)結(jié)果來看，酶解修飾的分離蛋白產(chǎn)品持水性均顯著下降，且水解度增大，持水性明顯降低。這是由于DH進(jìn)一步增大，形成更多的小分子，更加不利于形成蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（凝膠），導(dǎo)致蛋白的持水能力降低。同時(shí)研究表明：蛋白的持水性強(qiáng)弱能進(jìn)一步改善產(chǎn)品的溶脹特性，而良好的溶脹特性是良好持水性蛋白質(zhì)制品的必須具備條件之一。

2.4 不同DH的SPI的溶解性分析

測(cè)定不同DH的SPI的溶解性，結(jié)果見圖4所示。

圖4 不同DH的SPI的溶解性圖Fig.4 The solubility graph of soy separated protein with different hydrolysis

由圖4可以看出，不同DH的SPI的溶解性隨著水解度的增大而顯著性增加（P＜0.05），在 DH 為21.1%時(shí)，最終溶解性由（41.33±1.18）%升高至（61.25±0.96）%。這是由于隨著DH的提高，蛋白質(zhì)由大分子解離為小分子，蛋白質(zhì)顆粒變小，表面積增加，相互作用加強(qiáng)，因此溶解性增加。李秀川等[17]研究SPI經(jīng)水解后斷裂成小分子短鏈物質(zhì)，使得－NH2和－COOH的數(shù)目增多，極性增加，電荷密度增大，分子間相互排斥作用增加，親水性增強(qiáng)，從而提高了溶解性。這一點(diǎn)在實(shí)際生產(chǎn)中制造需要補(bǔ)充蛋白源的酸性飲料來說有著重要意義。

2.5 不同DH的SPI的RVA粘度分析

對(duì)不同DH的SPI的進(jìn)行RVA粘度分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同DH的SPI的RVA圖譜Fig.5 The graph of RVA of soy separated protein with different hydrolysis

由圖5可以看出，隨著DH的增加，SPI的最低粘度和最終粘度都呈降低的趨勢(shì)。RVA的最低粘度由629 cp降低至285 cp，RVA的最終粘度由1 945 cp降低至545 cp。這也許是由于蛋白質(zhì)天然三級(jí)結(jié)構(gòu)較致密，蛋白酶作用于大豆分離蛋白后，隨著水解的進(jìn)行，小分子肽類增多，分子量逐漸減小，與圖2電泳結(jié)果一致。反應(yīng)進(jìn)行中原來的蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，膨脹性減小，導(dǎo)致溶液RVA粘度下降。

食品工業(yè)生產(chǎn)中粘度是非常重要的指標(biāo)，通常根據(jù)其粘度來設(shè)計(jì)食品配方、控制結(jié)構(gòu)及適口性。在蛋白飲料或高蛋白果胨加工中，經(jīng)常會(huì)因?yàn)榇蠖沟鞍椎恼扯入S濃度增高而急劇升高、流動(dòng)性差、作業(yè)性不好而影響生產(chǎn)應(yīng)用，適當(dāng)程度的酶解具有抑制蛋白質(zhì)形成凝膠的性質(zhì)，還可以保持溶解狀態(tài)，更具有開發(fā)利用價(jià)值。

2.6 SPI的DH與特征值分析結(jié)果

對(duì)不同DH的SPI與其功能性指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果見表2所示。

表2 SPI的DH與其特征值的相關(guān)性Table 2 The correlation between DH and eigenvalue of SPI

試驗(yàn)結(jié)果表明：SPI的DH與RVA粘度值、持水性之間都呈顯著負(fù)相關(guān)，與溶解度之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。相關(guān)性數(shù)值較大，都大于0.9，說明其相關(guān)程度較大。蛋白質(zhì)的其他功能特性如起泡性、乳化性、凝膠形成性、潤濕性、水合性和分散性等的發(fā)揮都與溶解性密切相關(guān)，溶解性對(duì)蛋白質(zhì)的提取、純化、分離及加工條件的確定也是至關(guān)重要的[18-19]。

3 結(jié)論

綜上所述，研究60min內(nèi)酶解SPI的DH與其功能性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：隨著SPI的DH升高，其SPI的SDS-PAGE凝膠電泳顯示其分子量降低，小分子的蛋白逐漸增多，因?yàn)樗膺M(jìn)行時(shí)，蛋白質(zhì)分子中的疏水氨基酸及維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的氫鍵、范德華力、離子鍵等鍵也受到不同程度的破壞，進(jìn)而對(duì)大豆蛋白功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。隨著DH的增大，持水性逐漸降低，溶解性逐漸增加，粘度值也明顯降低。其不同DH的SPI與功能性相關(guān)性結(jié)果都在0.9以上，相關(guān)性較高；SPI的DH與RVA粘度值、持水性之間都呈顯著負(fù)相關(guān)，與溶解度之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。大豆分離蛋白酶解由于其功能特性發(fā)生了顯著的變化，因此，在食品加工中的應(yīng)用也就更為廣泛，選擇適當(dāng)?shù)拿附獬潭瓤梢詰?yīng)用于糕點(diǎn)及乳制品、蛋白飲料等加工過程中。

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