紹興腐乳發(fā)酵過程中酶活力和化學(xué)組分變化探究

◎ 謝小本

（紹興咸亨食品股份有限公司，浙江 紹興 312000）

在目前我國腐乳生產(chǎn)所應(yīng)用到的菌種中，紹興腐乳的發(fā)酵菌種總狀毛霉品質(zhì)優(yōu)良，在腐乳的發(fā)酵中十分重要。腐乳是我國民間傳統(tǒng)的美食，其制作流程為讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制。發(fā)酵過程看似簡單，但從生物化學(xué)的角度而言，腐乳的發(fā)酵非常復(fù)雜，其中包含了多種酶系的共同作用。在豆腐接種蛋白酶活力很強的根霉或毛霉菌的菌種，其中蛋白質(zhì)分解成為氨基酸以及其他物質(zhì)，另外蛋白酶和附著在菌皮上的細(xì)菌慢慢滲透豆腐坯內(nèi)部，分解蛋白質(zhì)，再經(jīng)過時間沉淀最后形成腐乳。腐乳制作成功的關(guān)鍵就是菌種的選擇，總狀毛霉借助良好的抗雜菌能力以及優(yōu)良的發(fā)酵性能在目前我國腐乳發(fā)酵中的應(yīng)用十分廣泛[1]。為了解腐乳發(fā)酵成熟指標(biāo)、縮短生產(chǎn)周期、提高腐乳品質(zhì)，本次研究重點分析腐乳在生產(chǎn)過程中的酶活力變化以及組分變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

總狀毛霉XH-22，紹興咸亨食品股份有限公司選育的生產(chǎn)用菌種。

1.2 實驗試劑、儀器

試劑：酪氨酸、果膠、福林酚試劑、三氯乙酸、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、麥芽糖、蛋白胨、脂肪酸、硫酸鎂和酵母膏。

儀器：HH.B11420-BS型電熱恒溫培養(yǎng)、828型酸度計、紫外分光光度計、高速冷凍離心機、超凈工作臺、生物顯微鏡。

1.3 培養(yǎng)基

黃泔水培養(yǎng)基：黃豆粉30 g、蔗糖3 g、硫酸鎂2 g、磷酸二氫鉀2 g、淀粉4 g補黃泔水至1 000 mL，113℃滅菌30 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 腐乳坯的制備

將實驗所需的豆腐切塊并擺好，使用高壓噴壺接種一定比例的總狀毛霉混合孢子懸液，每3塊豆腐接種1 mL混合孢子懸液，將其置于霉菌培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱的溫度與濕度制得腐乳坯。

1.4.2 腐乳發(fā)酵菌液制備

利用6%接種量，將種子培養(yǎng)菌液接種于已經(jīng)準(zhǔn)備好的黃泔水培養(yǎng)基中，溫度控制在28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.5 觀察指標(biāo)與測定方法

1.5.1 觀察指標(biāo)

對酶活力、腐乳前發(fā)酵酶活力、腐乳后發(fā)酵酶活力、腐乳后發(fā)酵化學(xué)組分變化進行測定分析。

1.5.2 測定方法

腐乳后發(fā)酵化學(xué)組分變化：①鹵湯成分以及含量為紹興酒86%、鹽7%、香料1%、味精5%、辣椒面1%。②氯化鈉含量的測定，參照SB/T10170-1993。③粗蛋白的測定，參照GB/T5009.5-2003。④脂肪測定，參照GB/T5009.6-2003。⑤游離脂肪酸的測定，參照GB/T15684-1995。⑥總酸的測定，參照GB/T5009.40-2003。⑦氨基酸態(tài)氮的測定，參照SB/T10170-1993。⑧還原糖含量的測定，參照SB/T10213-1994。

1.6 生產(chǎn)工藝

1.6.1 前期培菌

豆腐坯→接種（XH-22）→培養(yǎng)→涼花→搓毛。

1.6.2 后期發(fā)酵

腌坯（食鹽）→裹輔料→裝瓶（鹵湯）→封口→后發(fā)酵。

2 結(jié)果與分析

2.1 總狀毛霉XH-22培養(yǎng)

2.1.1 蛋白酶活力變化

通過分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵房培養(yǎng)條件下，XH-22發(fā)酵到30h是菌體產(chǎn)蛋白酶的高峰期，之后活力開始減弱。

2.1.2 粗蛋白的測定

通過研究發(fā)現(xiàn)，在18～30 h階段粗蛋白含量下降非?？?，30 h菌絲生物量達到高峰值。出現(xiàn)這種情況的原因可能是菌體在生長過程中直接利用培養(yǎng)液中的小分子氮源。

2.2 腐乳發(fā)酵酶活力變化

2.2.1 腐乳前發(fā)酵

通過分析發(fā)現(xiàn)，測定的酶系中，α-淀粉酶、脂肪酶活力在36 h達到最大值之后下降，蛋白酶、α-半乳糖苷酶、谷氨酰胺酶活力在48 h達到最大值隨后下降，糖化酶在30 h、纖維素酶在66 h、果膠酶活力在72 h達到最大值，隨后下降。通過分析發(fā)現(xiàn)，雖然不同酶在不同的時間達到最大值，但相同的是豆坯在培養(yǎng)36 h菌絲開始出現(xiàn)老化，如果繼續(xù)培養(yǎng)其質(zhì)量會出現(xiàn)明顯的下降。綜合各方面因素以及酶活力變化情況等結(jié)果，本次研究認(rèn)為豆坯發(fā)酵培養(yǎng)最理想的時間是32～34 h。

2.2.2 腐乳后發(fā)酵

分析發(fā)現(xiàn)，本次研究的蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纖維素酶、果膠酶發(fā)酵時間與酶活力成反比，只有谷氨酰胺酶發(fā)酵時間與酶活力成正比。隨著實驗的進行，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵至45 d，谷氨酰胺酶為86.3 U/g，基本形成了腐乳的風(fēng)味，該結(jié)果可以作為判斷腐乳成熟的一個參考指標(biāo)。

2.3 腐乳后發(fā)酵過程中化學(xué)組分的變化

腐乳生產(chǎn)過程中化學(xué)組分變化情況見表1，①腐乳生產(chǎn)過程中，化學(xué)組分中的粗蛋白、粗脂肪以及還原糖的含量與發(fā)酵時間成反比，這種情況的出現(xiàn)可能與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶、糖化酶會將粗蛋白、脂肪、還原糖分解有關(guān)。②氨基態(tài)氮、游離脂肪酸和總酸的含量和發(fā)酵時間成正比。游離脂肪酸是脂肪水解后得到的產(chǎn)物，大豆蛋白質(zhì)講解的最終產(chǎn)物是游離氨基酸，而游離氨基酸含量的高低直接關(guān)系到腐乳鮮味。在腐乳發(fā)酵的過程中，由于腐乳前發(fā)酵階段微生物分泌的脂肪酶會講解豆坯中的粗脂肪，最終增加游離脂肪酸的含量。③腐乳的酸度是有機酸、游離氨基酸、脂肪酸共同作用的結(jié)果，特別是在發(fā)酵60 d后酸度出現(xiàn)明顯性的一個增加，表明在發(fā)酵的后期有更多的酸性物質(zhì)生成。④腐乳發(fā)酵過程中的鹽分含量變化并不明顯。

表1 腐乳生產(chǎn)過程中化學(xué)組分變化情況表

3 討論

在豆腐的基礎(chǔ)上通過利用微生物進行發(fā)酵得到的大豆制品腐乳，因具有良好的感官性能且營養(yǎng)豐富，不僅深受國內(nèi)廣大群眾的喜歡，甚至已進入到其他國家的餐桌。以紹興腐乳生產(chǎn)為例，2016年紹興出口腐乳1 233 t，金額286.1萬美元，數(shù)量和金額同比分別增長11.6%和11.3%，主要市場是中國香港地區(qū)，其次是東南亞、北美及歐盟。

面對不斷增加的市場需求，實現(xiàn)腐乳的工業(yè)化生產(chǎn)成為滿足其市場需求的主要方式。目前，工業(yè)生產(chǎn)腐乳主要采用的菌種為毛霉菌屬和根霉菌屬。不同地區(qū)的腐乳在口感、感官性質(zhì)等方面都有一定差異，這與采用不同菌屬以及微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的不同酶有較大關(guān)聯(lián)。腐乳的生產(chǎn)過程實際上是一系列的生化變化——蛋白酶將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成多肽、氨基酸等小分子化合物。目前，食品研究相關(guān)報道顯示，28 ℃、200 r/min搖瓶條件下雅致放射毛霉在黃豆粉為原料的培養(yǎng)基中生長良好。正常情況下，在前期培菌的過程中，菌絲體會大量積累，到36～40 h逐漸穩(wěn)定。目前對總狀毛霉并沒有相關(guān)的研究報道，本次研究重點分析腐乳發(fā)酵過程中酶活力以及化學(xué)組分的變化情況，通過分析發(fā)現(xiàn)與，雖然搖瓶發(fā)酵與發(fā)酵房發(fā)酵的最佳培養(yǎng)時間不同，但通過對蛋白酶活力、粗蛋白的測定可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵30 h與搖瓶發(fā)酵36 h生長情況是一致的。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是發(fā)酵的轉(zhuǎn)速以及溶氧量較大，通過采用擴大培養(yǎng)的方式能夠?qū)l(fā)酵周期的時間提前，進一步可以認(rèn)為通過對總狀毛霉的深層培養(yǎng)可以取代現(xiàn)有的腐乳生產(chǎn)方式，進而達到發(fā)酵周期短、菌種純度高、生產(chǎn)效率提高的效果。

另外，為確保腐乳風(fēng)味以及感官效果，可以考慮采用多種酶系協(xié)同發(fā)酵的方式，本次研究通過利用XH-22對酶活力進行測定發(fā)現(xiàn)XH-22在豆坯上發(fā)酵的最佳時間是32～34 h?？紤]從化學(xué)組分角度進行分析發(fā)現(xiàn)，通過對腐乳前期培養(yǎng)、后期發(fā)酵過程中進行酶活力以及化學(xué)組分的變化分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺酶≥86.3 U/g、總酸≤1.3%、游離氨基態(tài)氮≥0.35%、還原糖≤1.1%及黏度≤2×105mPa·s時可以作為判斷腐乳成熟的參考標(biāo)準(zhǔn)之一。

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