全基因組關(guān)聯(lián)分析饅頭比容與質(zhì)構(gòu)SNP標(biāo)記

劉 娟 陳廣鳳 田紀(jì)春 吳 澎 趙子彤 楊 藝 李向陽(yáng) 唐曉珍

(山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，泰安 271018) (德州學(xué)院生態(tài)與景觀學(xué)院2，德州 253023) (山東農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥品質(zhì)育種研究室；山東省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，泰安 271018)

饅頭的比容和質(zhì)構(gòu)性狀作為影響?zhàn)z頭感官品質(zhì)和市場(chǎng)銷售的重要指標(biāo)，一直以來(lái)都是饅頭加工或品質(zhì)改良研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，目前對(duì)于饅頭比容和質(zhì)構(gòu)的研究多傾向于原料、添加劑以及小麥顆粒度等方面[1-6]，對(duì)加工技術(shù)的研究多于基礎(chǔ)研究。小麥?zhǔn)钱愒戳扼w作物，因而對(duì)其基因的研究相較于玉米[7]、水稻[8]等較晚，但近幾年檢測(cè)手段的進(jìn)步，使得對(duì)小麥農(nóng)藝性狀及品質(zhì)性狀的的基因研究日趨完善，但對(duì)小麥類產(chǎn)品如饅頭、面條等感官性狀的基因研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

隨著當(dāng)前單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記研究的快速發(fā)展，以及測(cè)序技術(shù)和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，自動(dòng)化程度更高的第3代SNP標(biāo)記已迅速取代SSR、RFLP等傳統(tǒng)標(biāo)記，成為最具有發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記[9]。SNP標(biāo)記遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多、分布廣且易于檢測(cè)的特點(diǎn)使其能滿足全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)大樣本、高密度標(biāo)記的要求，適合于數(shù)量龐大的檢測(cè)分析，可極大的提高關(guān)聯(lián)分析的效力[10-11]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于小麥遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[12-14]、分子標(biāo)記輔助育種[15-17]、遺傳分析和物種進(jìn)化等研究方面[18-20]。本研究以205份不同小麥品種為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析以求找到與饅頭比容和質(zhì)構(gòu)緊密關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，為從分子層面研究饅頭品質(zhì)性狀提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與表型鑒定

205份不同小麥品種，其中203份來(lái)自于中國(guó)10個(gè)種植冬小麥的省份，包括山東138份、河南24份、河北14份、安徽8份、江蘇6份、北京5份、陜西4份、甘肅2份、貴州與寧夏分別1份；剩余2份分別來(lái)自法國(guó)與墨西哥。其中，骨干親本132份，高代品系73份，高代品系均來(lái)源于山東省。

在2014年和2015年間分別將實(shí)驗(yàn)材料種植于山東泰安(山東農(nóng)業(yè)大學(xué))和山東德州(德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院)，播種時(shí)每份材料播種3行，行長(zhǎng)2 m，行間距0.25 m，均勻播種70粒。在小麥生長(zhǎng)期間，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的田間管理，沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的病蟲害及倒伏現(xiàn)象。待小麥成熟后將其進(jìn)行收割、標(biāo)記并研磨成粉。饅頭的制作參考周素梅等[21]的方法并略做改進(jìn)。待饅頭冷卻后開(kāi)始測(cè)量饅頭的質(zhì)量、體積與質(zhì)構(gòu)。饅頭的體積采用菜籽置換法測(cè)量，體積與質(zhì)量之比即為比容[22]；體積測(cè)量結(jié)束后，用切割機(jī)將饅頭沿豎直方向平行切割成3片，取中間片于質(zhì)構(gòu)儀上，在TPA模式下采用P35探頭進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)[23]，測(cè)試前速率3.00 mm/s，測(cè)試速率1.0 mm/s，測(cè)試后速率1.0 mm/s，下壓程度50%。第一次壓縮結(jié)束后，探頭回到起始位置，等待3 s后進(jìn)行第二次壓縮。并采用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)。

1.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根據(jù)稍作改動(dòng)的Triticarte(http://www.triticarte.com.au)方法提取小麥幼葉中DNA，并用0.8%的瓊脂糖電泳對(duì)提取到的DNA進(jìn)行濃度與質(zhì)量的檢測(cè)。委托加利弗尼亞大學(xué)生物技術(shù)檢測(cè)中心，使用最新開(kāi)發(fā)的90K基因芯片(含81 587個(gè)SNP)對(duì)實(shí)驗(yàn)材料DNA進(jìn)行分型，并利用Genome Studio軟件對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行讀取及保存。為確保得到的基因數(shù)據(jù)的質(zhì)量，用PLINK v1.07對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[24]，選取檢出率大于0.8和低頻基因頻率大于0.05的SNP標(biāo)記，最終得到24 355個(gè)SNP用于饅頭比容和質(zhì)構(gòu)關(guān)聯(lián)分析。

在參照Wang等[25]整合的遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，得到本實(shí)驗(yàn)群體的SNP復(fù)合遺傳圖譜信息(表1)。

1.3 性狀與標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用TASSEL 3.0軟件中的MLM模型對(duì)饅頭比容及質(zhì)構(gòu)性狀與標(biāo)記之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，當(dāng)結(jié)果中關(guān)聯(lián)標(biāo)記的P<0.001時(shí)，認(rèn)為該標(biāo)記與目標(biāo)性狀存在顯著關(guān)聯(lián)；P<0.000 1時(shí)，認(rèn)為標(biāo)記與目標(biāo)性狀存在極顯著關(guān)聯(lián)，當(dāng)標(biāo)記在2個(gè)及以上環(huán)境中同時(shí)被檢測(cè)到則認(rèn)為其是目標(biāo)性狀相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 比容與質(zhì)構(gòu)性狀表型變異分析

4個(gè)環(huán)境下，小麥粉饅頭比容與質(zhì)構(gòu)表型數(shù)據(jù)如表2所示。各性狀均有較大的變異系數(shù)，表2中，E4環(huán)境下饅頭比容性狀的變異系數(shù)最大(19.54%)，E1環(huán)境下變異系數(shù)最小(8.45%)；表3中，E1環(huán)境黏著性變異系數(shù)最大(58.50%)，彈性變異系數(shù)最小(3.21%)。除個(gè)別環(huán)境外，各性狀的偏度和峰度的絕對(duì)值大部分都小于1，符合正態(tài)分布，表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳，適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

表1 SNP復(fù)合遺傳圖譜信息

表2 四個(gè)環(huán)境下饅頭比容、質(zhì)構(gòu)在群體中的表型數(shù)據(jù)

表2(續(xù))

注：E1：2014年泰安點(diǎn)；E2：2014年德州點(diǎn)；E3：2015年泰安點(diǎn)；E4：2015年德州點(diǎn)，余同。

表3 四個(gè)環(huán)境中與饅頭比容、質(zhì)構(gòu)性狀相關(guān)的極顯著(P<0.000 1)、高貢獻(xiàn)率和穩(wěn)定位點(diǎn)

表3(續(xù))

2.2 SNP標(biāo)記與饅頭比容、質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)對(duì)4個(gè)環(huán)境中小麥粉饅頭性狀與標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)分析，共得到42個(gè)比容性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(P<0.001)，分布于小麥21條染色體中的16條，單個(gè)位點(diǎn)表型遺傳變異貢獻(xiàn)率為6.57%～18.31%。其中8個(gè)極顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(P<0.000 1)，同時(shí)也是高遺傳貢獻(xiàn)率位點(diǎn)(R2>10%)，2個(gè)相對(duì)穩(wěn)定位點(diǎn)(在2個(gè)及以上環(huán)境中表達(dá))，分布于小麥的2A、2B、2D、3A、4B、6B、7A染色體上。位于4B染色體上的極顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Tdurum_contig4974_355遺傳貢獻(xiàn)率最大，可解釋17.10%的表型變異，但只在E4環(huán)境中檢測(cè)到(表3)。

4個(gè)環(huán)境下共檢測(cè)到313個(gè)質(zhì)構(gòu)性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布于小麥的17條染色體上，單個(gè)位點(diǎn)表型變異貢獻(xiàn)率為5.49%～25.14%。其中31個(gè)極顯著(P<0.000 1)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，11個(gè)相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，46個(gè)高遺傳貢獻(xiàn)率位點(diǎn)，分布于小麥的15條染色體上(1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、5B、5D、6A、7A、7B和7D)。同時(shí)，檢測(cè)到5個(gè)極顯著位點(diǎn)，如3B染色體上黏聚性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Kukri_c13329_800、7B染色體上咀嚼性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Tdurum_contig61884_836等，在2個(gè)環(huán)境中表達(dá)，且貢獻(xiàn)率大于10%，為主效關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

3 討論

標(biāo)記本身的特性決定了其在遺傳連鎖圖譜上的分布密度，進(jìn)而對(duì)其所定位的QTL產(chǎn)生影響，本研究整合的遺傳連鎖圖譜全長(zhǎng)3 674.16 cm，標(biāo)記間平均距離0.15 cm，且標(biāo)記的數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)4 000個(gè)。因此，該圖譜具有分子標(biāo)記數(shù)目較多，覆蓋的遺傳距離長(zhǎng)，標(biāo)記間平均距離小等突出特點(diǎn)，且該圖譜的建成將有助于鑒別和挖掘優(yōu)異的遺傳變異位點(diǎn)。在所有的標(biāo)記中，B染色體組檢測(cè)到的標(biāo)記數(shù)目最多，A染色體組次之，D染色體組標(biāo)記數(shù)目最少，這可能是由于小麥D染色體組具有相對(duì)較高的保守性造成的[26]。

本研究利用SNP標(biāo)記對(duì)饅頭比容和質(zhì)構(gòu)相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，采用MLM模型，將協(xié)變量(每個(gè)品種個(gè)體的Q值、親緣關(guān)系)納入回歸分析，并設(shè)置較高的閾值(P≤0.000 1)來(lái)防止因親緣關(guān)系和群體分層所引發(fā)的偽關(guān)聯(lián)，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。在不同環(huán)境中所得到的位點(diǎn)常會(huì)出現(xiàn)不一致的情況，或許是由于環(huán)境的作用，這是多基因控制的數(shù)量性狀的首要特點(diǎn)。有些位點(diǎn)在2個(gè)及以上環(huán)境中同時(shí)被檢測(cè)到，被稱作相對(duì)穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。與SSR標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記與功能基因的關(guān)聯(lián)更加緊密，這是由于SNP標(biāo)記不僅在小麥基因中有遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多等特點(diǎn)，而且有些基因內(nèi)的SNP會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達(dá)有直接影響[27]。本研究通過(guò)關(guān)聯(lián)分析得到2個(gè)比容性狀相對(duì)穩(wěn)定位點(diǎn)，11個(gè)質(zhì)構(gòu)性狀相對(duì)穩(wěn)定位點(diǎn)，如E1、E4環(huán)境中同時(shí)檢測(cè)到的與比容顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)tplb0027d07_633,E1、E4個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到的與硬度關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)BobWhite_c8436_391等，可作為參考應(yīng)用于小麥分子標(biāo)記輔助育種。

4 結(jié)論

利用分布于小麥全基因組的24 355個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)205份不同小麥粉饅頭的比容和質(zhì)構(gòu)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。檢測(cè)到42個(gè)饅頭比容性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中8個(gè)極顯著(P<0.000 1)且高遺傳貢獻(xiàn)位點(diǎn)，2個(gè)相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布于小麥的7條染色體上。檢測(cè)到313個(gè)饅頭質(zhì)構(gòu)性狀顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，有31個(gè)極顯著(P<0.000 1)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，11個(gè)相對(duì)穩(wěn)定關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，46個(gè)高遺傳貢獻(xiàn)率位點(diǎn)(R2>10%)，分布于小麥的15條染色體上。同時(shí)，檢測(cè)到5個(gè)質(zhì)構(gòu)性狀主效關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)所得到的這些標(biāo)記對(duì)從分子水平深入研究小麥粉的品質(zhì)性狀具有重要意義，并為小麥分子育種提供參考。

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