運(yùn)動(dòng)干預(yù)延緩骨骼肌衰老的作用及機(jī)制

張麗麗

(湖州師范學(xué)院，浙江 湖州 313000)

隨著年齡增加，骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生退行性變化，加速了心血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及其他組織器官的衰老〔1〕。因此，從骨骼肌衰老問題著手緩解整個(gè)機(jī)體衰老具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，將中青年大鼠GDF11蛋白基因敲除后骨骼肌出現(xiàn)類似衰老大鼠的特征〔2〕，提示GDF11蛋白與骨骼肌衰老存在關(guān)聯(lián)。研究已證實(shí)，骨骼肌減少具有可訓(xùn)練性〔3〕，但其內(nèi)在機(jī)制仍需探討，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與老齡骨骼肌組織中GDF11蛋白表達(dá)的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本次研究探索不同參數(shù)的間隙式負(fù)重運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡骨骼肌衰老的影響，并分析與骨骼肌組織中GDF11蛋白表達(dá)的相關(guān)性，探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)骨骼肌減少的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠24只，17月齡，體重(450±20)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。溫度(24±2)℃、相對(duì)濕度40%～60%條件下分籠喂養(yǎng)，4只/籠，自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后稱量體重，隨機(jī)數(shù)字法分對(duì)照組(不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù))、低負(fù)重組、中等負(fù)重組、高負(fù)重組，每組6只。

1.2訓(xùn)練方法 首先進(jìn)行無負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練7 d，各運(yùn)動(dòng)組大鼠參加，跑臺(tái)速度設(shè)定為10 m/min，30 min/d，坡度0°。之后進(jìn)行負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練7 d，各運(yùn)動(dòng)組大鼠參加，跑臺(tái)設(shè)置與無負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練相同，30 min/d，在腰背部捆綁條形負(fù)荷，負(fù)重為最大負(fù)重強(qiáng)度的10%；最大負(fù)重強(qiáng)度獲取方法：逐漸在大鼠腰背部增加重量，到無法正常行走為止。正式負(fù)重訓(xùn)練：各運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行為期8 w的負(fù)重訓(xùn)練，低負(fù)重組(40%最大負(fù)重)、中等負(fù)重組(60%最大負(fù)重)、高負(fù)重組(70%最大負(fù)重)，跑臺(tái)速度設(shè)定為15 m/min，坡度0°，跑3 min、休息3 min，每次共訓(xùn)練6組，1次/d，周日休息。

1.3標(biāo)本采集與處理 正式負(fù)重第8周結(jié)束后，大鼠禁食、禁水12 h，稱重后取股直肌組織標(biāo)本。腹腔注射50 mg/kg劑量的1%戊巴比妥鈉全麻后，取左側(cè)中段股直肌為骨骼肌標(biāo)本，剔去周圍脂肪，4℃蒸餾水中洗凈，液氮凍干，-80℃保存待測。

1.4骨骼肌形態(tài)學(xué)觀察及勻漿指標(biāo)測定 取部分骨骼肌組織，冷凍切片，常規(guī)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察切片，分析各組大鼠骨骼肌形態(tài)學(xué)改變。分別取各組大鼠骨骼肌組織300 mg，勻漿后使用脂褐質(zhì)檢測試劑盒(熒光比色法)測定脂褐質(zhì)含量，使用鈣檢測試劑盒(甲基麝香草酚藍(lán)比色法)測定組織中鈣含量，上述操作均按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5Western印跡檢測骨骼肌組織中GDF11蛋白表達(dá) 分別取各組冷凍骨骼肌組織20 mg，加RIPA蛋白裂解液后冰上勻漿，離心取上清，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒檢測抽提蛋白的濃度；行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將靶向蛋白濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加GDF11單抗隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，室溫下孵育3 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒處理，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，分析各條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為表現(xiàn)及體重變化 大鼠實(shí)驗(yàn)前精神狀態(tài)良好，飲水、飲食積極；訓(xùn)練初期各負(fù)重組大鼠飲水、飲食積極性欠佳，隨著時(shí)間延長逐漸增加，最終明顯高于對(duì)照組；中等及高負(fù)重組大鼠訓(xùn)練間隙和訓(xùn)練后均表現(xiàn)出程度不同的疲勞現(xiàn)象，但次日訓(xùn)練時(shí)均已恢復(fù)正常，低負(fù)重組大鼠疲勞現(xiàn)象不明顯。運(yùn)動(dòng)后，各負(fù)重組大鼠精神狀態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照組，表現(xiàn)為對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏度更高，自主活動(dòng)較多。訓(xùn)練前各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)6 w訓(xùn)練后各負(fù)重組大鼠體重均明顯低于訓(xùn)練前和對(duì)照組(P<0.05)，其中以高負(fù)重組最明顯。見表1。

表1 各組大鼠訓(xùn)練前后體重比較

與訓(xùn)練前相比:1)P<0.05；與對(duì)照組相比:2)P<0.01

2.2各組大鼠骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色顯示，各組大鼠骨骼肌纖維組織均出現(xiàn)不同程度的圓形化，細(xì)胞排列錯(cuò)亂且大小不一，細(xì)胞間隙增大，可見白色組織填充；其中以對(duì)照組大鼠最明顯，高負(fù)重組次之，低、中負(fù)重組較另外兩組細(xì)胞排列更緊密；中、高負(fù)重組大鼠部分肌細(xì)胞的直徑較大。見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌組織形態(tài)(HE，×400)

2.3各組大鼠骨骼肌勻漿脂褐質(zhì)及鈣濃度水平比較 對(duì)照組與高負(fù)重組、低負(fù)重組與中等負(fù)重組之間脂褐質(zhì)濃度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低負(fù)重組與中等負(fù)重組的脂褐質(zhì)濃度明顯低于對(duì)照組與高負(fù)重組(P<0.05)。各負(fù)重組大鼠骨骼肌中鈣濃度均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，其中以低負(fù)重組鈣離子濃度升高最明顯。見表2。

表2 6 w訓(xùn)練后各組大鼠骨骼肌勻漿脂褐質(zhì)及鈣濃度水平比較

與對(duì)照組相比：1)P<0.01

2.4各組大鼠骨骼肌GDF11蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組、低負(fù)重組、中等負(fù)重組、高負(fù)重組大鼠骨骼肌GDF11蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.61±0.58、4.70±0.81、4.53±0.69、2.45±0.86，其中對(duì)照組與高負(fù)重組、低負(fù)重組與中等負(fù)重組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低負(fù)重組與中等負(fù)重組GDF11蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和高負(fù)重組(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠骨骼肌GDF11蛋白Western印跡電泳圖

3 討 論

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，間隙運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌具有保護(hù)作用，還可促進(jìn)骨骼肌能量供應(yīng)〔4〕。考慮到本實(shí)驗(yàn)中使用的老齡大鼠心肺功能存在衰退，故選用跑3 min、休息3 min的間隙訓(xùn)練方式；同時(shí)經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定大鼠最大負(fù)重水平，并分別給予40%、60%、70%最大負(fù)重反映不同負(fù)荷強(qiáng)度。運(yùn)動(dòng)前后對(duì)大鼠行為表現(xiàn)觀察顯示，間隙負(fù)重運(yùn)動(dòng)干預(yù)可緩解自然衰老進(jìn)程，增強(qiáng)神經(jīng)肌肉功能活性水平，其中低負(fù)重組大鼠改善更明顯，提示40%最大負(fù)重是老年大鼠較為合適的運(yùn)動(dòng)刺激。

正常衰老過程中，體內(nèi)細(xì)胞需對(duì)抗自由基損傷、病原菌入侵等各種外界刺激；細(xì)胞膜為第一道屏障〔5〕。本次研究中老年大鼠骨骼肌纖維組織出現(xiàn)了不同程度的圓形化，可能為細(xì)胞膜受外界刺激導(dǎo)致的結(jié)果；細(xì)胞間隙增大，有白色組織填充可能為老齡骨骼肌中積累的脂肪填充效果。經(jīng)間隙負(fù)重運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，低負(fù)重組和中等負(fù)重組大鼠骨骼肌纖維組織圓形化程度明顯降低，細(xì)胞排列更緊密，提示骨骼肌細(xì)胞間隙脂肪含量明顯降低，且未對(duì)肌纖維組織造成過度損傷，延緩了正常衰老進(jìn)程；而高負(fù)重組肌細(xì)胞間隙脂肪含量增多，可能由于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過大對(duì)骨骼肌細(xì)胞造成了損傷；此外，中、高負(fù)重組大鼠肌細(xì)胞直徑變大，說明該運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可刺激部分肌纖維增粗。

脂褐質(zhì)是體內(nèi)不飽和脂肪酸對(duì)抗自由基損傷時(shí)生成的產(chǎn)物，可作為反映組織衰老的標(biāo)志物〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示40%和60%最大負(fù)荷量間隙運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)骨骼肌內(nèi)自由基清除速率，進(jìn)而降低脂褐質(zhì)水平，延緩骨骼肌衰老；而70%負(fù)荷間隙運(yùn)動(dòng)屬于超負(fù)荷，對(duì)骨骼肌自由基代謝產(chǎn)生了負(fù)面影響。鈣是骨骼肌活動(dòng)的主要耦聯(lián)因子，微量的鈣元素由胞外流入胞內(nèi)即可對(duì)骨骼肌纖維產(chǎn)生明顯影響〔7〕。老齡大鼠因肌肉自身結(jié)構(gòu)改變引發(fā)胞內(nèi)鈣虧空，對(duì)胞外鈣的依賴性更高，若未得到有效補(bǔ)充，會(huì)加速肌肉衰退〔8〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，各負(fù)重組骨骼肌中鈣濃度均明顯高于對(duì)照組。說明負(fù)重間隙運(yùn)動(dòng)可動(dòng)員更多胞外鈣，刺激機(jī)體為骨骼肌分配更多的鈣量來保證較好的運(yùn)動(dòng)功能，延緩骨骼肌衰老。GDF11蛋白是胞外鈣流入胞內(nèi)的重要調(diào)控蛋白之一，可促進(jìn)胞外鈣內(nèi)流；同時(shí)GDF11蛋白對(duì)維持骨骼肌正常解剖結(jié)構(gòu)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)顯示，低、中等負(fù)重組GDF11蛋白水平明顯高于高負(fù)重組和對(duì)照組，可能與低、中負(fù)重強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)刺激對(duì)老年大鼠較適宜，可直接或間接誘發(fā)骨骼肌組織中GDF11蛋白增多；同時(shí)還可負(fù)向影響骨骼肌收縮機(jī)制，導(dǎo)致GDF11蛋白代謝減慢。

4 參考文獻(xiàn)

1夏 志，趙 艷，尚畫雨，等.衰老個(gè)體骨骼肌蛋白質(zhì)代謝相關(guān)問題〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(14)：3604-7.

2樊申元，靳二輝.PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)自然衰老小鼠骨骼肌自噬的影響及不同運(yùn)動(dòng)方式的調(diào)控〔J〕.沈陽體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2016；35(1)：82-6，92.

3Egerman MA，Cadena SM，Gilbert JA,etal.GDF11 increases with age and inhibits skeletal muscle regeneration〔J〕.Cell Metab，2015；22(1)：164-74.

4趙麗霞，李 蓉，熊東林，等.人骨骼肌成肌細(xì)胞體外分化的全程觀察及INK4a信號(hào)通路對(duì)其衰老的誘導(dǎo)研究〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013；30(7)：1383-6.

5馬 波，陳忠誠.肝纖維化組織中抗衰老蛋白及抗增殖蛋白的表達(dá)及其作用機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(20)：4978-80.

6杜少輝，李文惠，閆萬軍，等.骨骼肌衰老與力量-速度的關(guān)系〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011；15(7)：1273-6.

7苗小寶，孟昭琴，王美樂，等.補(bǔ)充天然蝦青素和遞增游泳對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌自由基代謝的影響〔J〕.當(dāng)代體育科技，2016；6(35)：25-7.

8劉豐彬.綜合干預(yù)對(duì)D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌自由基和激素代謝影響的研究〔J〕.大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2017；38(3)：75-81，85.