叉頭框蛋白E1對肝癌細胞侵襲及遷移能力的影響

張 雯 姚豫桐

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院肝膽胰脾&細胞移植中心，四川 成都 610072)

超過80%的肝癌患者在確診時已經(jīng)處于癌癥晚期，治療后5年內(nèi)生存率低于3%〔1，2〕。肝癌易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)是肝癌致死的重要原因，探究肝癌的發(fā)病機制，尋找有效方法提高肝癌患者的生存期是重中之重〔3〕。叉頭框蛋白(FOX)E1屬于FOX家族的成員，在胚胎發(fā)育、分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究報道，F(xiàn)OXE1在基底細胞癌、甲狀腺癌、皮膚鱗癌等中異常表達，并且在癌細胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮決定性作用〔4～6〕。FOXE1在肝癌中表達異常下調(diào)，而對于其在肝癌細胞侵襲和遷移中的作用尚不清楚〔7〕。本實驗對FOXE1在體外肝癌細胞侵襲和遷移中的作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料 肝癌細胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝細胞HL7702購自中科院細胞庫；FOXE1 pcDNA3.1購自美國OriGene；FOXE1、β-actin引物均由上海生工合成；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Amersham Biosceiences；胎牛血清購自美國Biochrom；DMEM購自美國Sigma；FOXE1抗體購自美國Bioworld；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa；qRT-PCR試劑盒購自南京Vazyme；Lipofectamine2000購自美國 invitrogen；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體購自美國CTS。

1.2qRT-PCR測定FOXE1在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達 取人肝癌細胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝細胞HL7702，提取細胞中的RNA，用核酸蛋白儀分析A260/A280的比值1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成產(chǎn)物保存在-20℃。qRT-PCR測定FOXE1水平。引物：FOXE1-正義鏈：5′-GACCACGGTGGACTTCTAGCG-3′，F(xiàn)OXE1-反義鏈：5′-CCCTAC-GCTGGCTCACAT-3′。β-actin-正義鏈：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，β-actin-反義鏈：5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)PCR反應(yīng)曲線得出閾值循環(huán)數(shù)，分析Ct值，用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達水平。

1.3Western印跡測定FOXE1在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達 取人肝癌細胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝細胞HL7702，在冰上提取細胞蛋白，步驟參照細胞蛋白提取試劑盒。用BCA法對蛋白定量。按照每組40 μg蛋白樣品進行蛋白電泳。在上樣前，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合煮沸5 min后，放在冰上備用。30 mA電流電泳，觀察染料進入到分離膠和濃縮膠的交界處以后，把電流調(diào)整到20 mA，直到染料進入到分離膠的底部以后，將凝膠取出，進行轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜電泳用250 mA，轉(zhuǎn)膜時間為2 h)、封閉(5%脫脂奶粉，室溫，封閉1 h)。取出膜，與按照1∶800稀釋的FOXE1一抗在4℃過夜以后，再與1∶2 000稀釋的二抗在室溫反應(yīng)2 h。用ECL顯色，曝光后，用Image J分析條帶的灰度值。FOXE1蛋白水平=FOXE1灰度值/β-actin灰度值。

1.4細胞轉(zhuǎn)染和分組 用Lipofectamine2000將FOXE1 pcDNA3.1和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到HCCLM3細胞中，步驟參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將轉(zhuǎn)染后的細胞依次命名為FOXE1組和Vector組，并且以不做轉(zhuǎn)染的細胞命名為WT組，在轉(zhuǎn)染后的24 h，分別用qRT-PCR和Western印跡測定各組細胞中的FOXE1轉(zhuǎn)錄和表達水平，步驟同上。

1.5細胞劃痕實驗測定細胞遷移 WT、FOXE1、Vector組細胞在轉(zhuǎn)染后，用細胞培養(yǎng)液把細胞濃度調(diào)整為每毫升含有1×106個細胞，接種到6孔板中，每孔中添加1 ml的細胞懸液，培養(yǎng)過夜以后，觀察細胞長滿底部以后，用無菌的移液槍槍頭在底部劃出一條細痕，用PBS把劃下的細胞去除以后，每孔添加2 ml的細胞懸浮液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。測量0 h和24 h細胞劃痕的寬度，計算細胞遷移率。遷移率=100%×(0 h細胞劃痕的寬度-24 h細胞劃痕的寬度)/0 h細胞劃痕的寬度。

1.6Transwell小室測定細胞侵襲 WT、FOXE1、Vector細胞在轉(zhuǎn)染后用Transwell小室測定細胞侵襲能力。用不含血清的培養(yǎng)液把各組細胞制成單細胞懸浮液，密度為1×106個/ml。在侵襲實驗前30 min，用基質(zhì)膠濕化Transwell小室。把上述100 μl細胞懸浮液加入到Transwell小室的上室，在下室中添加600 μl的含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液。孵育24 h以后，用甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下觀察細胞侵襲個數(shù)。

1.7Western印跡測定MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平 WT、FOXE1、Vector細胞在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，Western印跡方法測定細胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平，步驟同上。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1FOXE1在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達 肝癌細胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3中FOXE1 mRNA和蛋白水平均明顯低于正常肝細胞HL7702，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HCCLM3細胞中的FOXE1 mRNA和蛋白水平明顯低于HepG2細胞和SMCC7721細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。FOXE1在肝癌細胞中低表達，且在HCCLM3細胞中的表達水平最低，選用HCCLM3細胞做后續(xù)實驗。見圖1和表1。

圖1 Western印跡測定肝癌細胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝細胞HL7702中FOXE1蛋白水平

表1 肝癌細胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝細胞HL7702中FOXE1 mRNA和蛋白表達水平比較

與HL7702相比：1)P<0.05；與HCCLM3相比：2)P<0.05

2.2FOXE1在轉(zhuǎn)染后細胞中的表達 FOXE1組FOXE1 mRNA和蛋白水平均明顯高于WT組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Vector組FOXE1 mRNA和蛋白水平與WT相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。FOXE1過表達載體可以促進肝癌細胞中的FOXE1的轉(zhuǎn)錄和表達。見圖2和表2。

圖2 Western印跡測定轉(zhuǎn)染后的HCCLM3細胞中FOXE1蛋白水平

表2 各組細胞中FOXE1 mRNA和蛋白表達水平比較

與WT相比：1)P<0.05，下表同

2.3FOXE1對肝癌細胞侵襲及遷移影響 FOXE1組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)目均明顯低于WT組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Vector組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)目與WT組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。FOXE1過表達載體可以降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力。見表3。

表3 各組細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)目比較

2.4FOXE1對肝癌細胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響 FOXE1組MMP-2、N-cadherin、Vimentin蛋白水平均明顯低于WT組，而E-cadherin水平明顯高于WT組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Vector組MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平與WT組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。FOXE1過表達載體可以促進肝癌細胞中E-cadherin表達，抑制細胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達。見圖3和表4。

圖3 Western印跡測定MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達

表4 各組細胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平比較

3 討 論

叉頭框家族是一個十分龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，其成員都含有一個典型的叉頭區(qū)域，該蛋白家族能夠影響細胞的生長、分化等多種生物學(xué)功能，與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)〔8〕。FOXE1是叉頭框家族成員之一，最初發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控甲狀腺的生長，是一種重要的甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子，能夠影響甲狀腺濾泡細胞的生長〔9〕。研究表明，F(xiàn)OXE1在腫瘤中表達異常，并且與腫瘤的惡性程度有關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)的與FOXE1有關(guān)的惡性腫瘤主要有結(jié)直腸癌、胰腺癌、白血病、大腸癌等〔10～13〕。在大腸癌中提高FOXE1的表達后，大腸癌細胞的惡性程度降低，細胞侵襲能力下降〔13〕。周宇帆〔7〕檢測了肝癌細胞中FOXE1 mRNA水平發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXE1 mRNA在肝癌中低表達，并且其表達水平的高低與肝癌血管侵犯、包膜侵犯等有關(guān)。

腫瘤轉(zhuǎn)移大致分為4步：首先腫瘤從原發(fā)部位脫落以后穿過基底膜進入到間質(zhì)中；其次，腫瘤細胞通過在間質(zhì)中的移行到達脈管周圍；第三，腫瘤穿過血管內(nèi)皮組織進入到血液中；第四，腫瘤細胞穿過血管，進入到新的組織中，增殖形成新的病灶〔14～16〕。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞降解細胞外基質(zhì)是關(guān)鍵步驟，細胞外基質(zhì)的主要成分為Ⅳ型膠原酶，因此，Ⅳ型膠原酶也是阻礙腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要屏障。MMPs是細胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶，其中MMP-2是目前發(fā)現(xiàn)的降解Ⅳ型膠原酶的主要蛋白酶，其可以打破外基質(zhì)的降解平衡，誘導(dǎo)腫瘤細胞穿過組織屏障向鄰近組織轉(zhuǎn)移〔17，18〕。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中其上皮細胞特征逐漸減弱，間質(zhì)細胞特征逐漸明顯，這被稱之為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，E-cadherin是上皮細胞的標(biāo)志物，而N-cadherin、Vimentin是間質(zhì)細胞的標(biāo)志物，其在肝癌中異常表達〔19，20〕。

本實驗說明FOXE1在肝癌細胞中表達降低，F(xiàn)OXE1可以降低肝癌細胞降解細胞外基質(zhì)的能力，降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力，抑制肝癌細胞EMT，F(xiàn)OXE1可能在肝癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。

FOXE1在多種腫瘤中異常表達，并且可以影響腫瘤細胞的多種生物學(xué)特性，而本實驗證明，F(xiàn)OXE1可能作為一種抑癌基因參與肝癌轉(zhuǎn)移，F(xiàn)OXE1可以降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力，抑制肝癌細胞EMT，其具體的作用機制需要在以后的實驗中進行探討，這對于今后研究肝癌的發(fā)病機制具有重要意義。

4 參考文獻

1Kudo M，Matsui O，Izumi N，etal.JSH consensus-based clinical practice guidelines for the management of hepatocellular carcinoma：2014 update by the liver cancer study group of Japan〔J〕.Liver Cancer，2014;3(3-4)：458-68.

2Yoshimoto S，Loo TM，Atarashi K，etal.Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome〔J〕.Nature，2013;499(7456)：97-101.

3Pediconi N，Lupacchini L，Salerno D，etal.SAT-424-EZH2 methyltransferase and JMJD3/UTX demethylases are involved in hepatocytic differentiation and liver cancer cells plasticity〔J〕.J Hepatol，2017;66(1)：S644-5.

4Tomaz RA，Sousa I，Silva JG，etal.FOXE1 polymorphisms are associated with familial and sporadic nonmedullary thyroid cancer susceptibility〔J〕.Clin Endocrinol，2012;77(6)：926-33.

5Eichberger T，Regl G，Ikram MS，etal.FOXE1，a new transcriptional target of GLI2 is expressed in human epidermis and basal cell carcinoma〔J〕.J Invest Dermatol，2004;122(5)：1180-7.

6Venza I，Visalli M，Tripodo B，etal.FOXE1 is a target for aberrant methylation in cutaneous squamous cell carcinoma〔J〕.Br J Dermatol，2010;162(5)：1093-7.

7周宇帆.FOXC2 和 FOXEl 在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及臨床意義〔D〕.長沙：中南大學(xué)，2013.

8張錦錦，唐 慧.叉頭框 Q1 基因調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展的研究進展〔J〕.腫瘤，2017;37(2)：177-83.

9Jiang W，Zheng L，Xu L，etal.Association between FOXP3，F(xiàn)OXE1 gene polymorphisms and risk of differentiated thyroid cancer in Chinese Han population〔J〕.Mol Biol，2015;4(3)：1-5.

10龍亞東.FOXE-1 甲基化與表達的關(guān)聯(lián)分析及其與結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究〔D〕.上海：復(fù)旦大學(xué)，2013.

11Sato N，F(xiàn)ukushima N，Maitra A，etal.Discovery of novel targets for aberrant methylation in pancreatic carcinoma using high-throughput microarrays〔J〕.Cancer Res，2003;63(13)：3735-42.

12Rush LJ，Raval A，F(xiàn)unchain P，etal.Epigenetic profiling in chronic lymphocytic leukemia reveals novel methylation targets〔J〕.Cancer Res，2004;64(7)：2424-33.

13黃鐘庭.FOXE1在大腸癌中的表達及其功能研究〔D〕.杭州：浙江大學(xué)，2014.

14胡偉國，林金葉，宋啟斌.炎癥小體與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進展〔J〕.腫瘤學(xué)雜志，2016;22(2)：99-105.

15劉 華，楊貴義，欽傳輝.槐耳清膏對手術(shù)切除結(jié)腸癌后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的影響及其機制研究〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016;25(9)：968-70.

16Zhuang HH，Xue W，Ping W.Transcription factor cAMP response element binding protein mediates tumor metastasis and the related molecular mechanism〔J〕.Acta Anat Sin，2015;46(1)：138-44.

17Shi F，Xiao F，Ding P，etal.Long noncoding RNA highly up-regulated in liver cancer predicts unfavorable outcome and regulates metastasis by MMPs in triple-negative breast cancer〔J〕.Arch Med Res，2016;47(6)：446-53.

18Li X，Wu JF.Recent developments in patent anti-cancer agents targeting the matrix metalloproteinases (MMPs)〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2010;5(2)：109-41.

19Zhang J，Guo Y.The expression of N-cadherin and vimentin in rectum adenocarcinoma and their clinical value〔J〕.Chongqing Med，2014;43(8)：935-4.

20Bhat FA，Sharmila G，Balakrishnan S，etal.Quercetin reverses EGF-induced epithelial to mesenchymal transition and invasiveness in prostate cancer (PC-3) cell line via EGFR/PI3K/Akt pathway〔J〕.J Nutr Biochem，2014;25(11)：1132-9.