維生素D受體對高糖環(huán)境下足細(xì)胞凋亡及Caspase-3活化水平的影響及機(jī)制

江流芳 勞雅琴 馬慶華 趙宗權(quán)

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)部，江蘇 蘇州 215009)

足細(xì)胞過度凋亡是糖尿病腎病發(fā)生的重要原因，用高糖處理足細(xì)胞是目前常見的研究糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的體外模型〔1〕。足細(xì)胞損傷與腎小球硬化、蛋白尿有關(guān)〔2,3〕。維生素D受體(VDR)在多種細(xì)胞中存在，與機(jī)體內(nèi)鈣磷等的代謝有關(guān)，能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、蛋白尿產(chǎn)生等有關(guān)〔4～6〕。研究表明，糖尿病小鼠經(jīng)VDR基因敲除后，小鼠腎組織中足細(xì)胞數(shù)量急劇減少，出現(xiàn)蛋白尿、腎小球硬化等病理癥狀〔7,8〕。本實驗旨在探討VDR對高糖環(huán)境下足細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 人腎臟足細(xì)胞HPC購自中科院細(xì)胞庫；qRT-PCR試劑盒為美國DBI BIOSCIENCE產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為北京BioTeke公司產(chǎn)品；VDR、β肌動蛋白(β-actin)引物由上海生工合成；VDR多克隆抗體為美國abacm產(chǎn)品；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3多克隆抗體、磷酸化的STAT3(p-STAT3)多克隆抗體為美國BBI Life Science產(chǎn)品；p38多克隆抗體、磷酸化的p38(p-p38)多克隆抗體為美國CTS產(chǎn)品；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為上海凱基公司產(chǎn)品；VDR真核表達(dá)載體pcDNA3.1-VDR由上海吉瑪構(gòu)建；重組 γ-干擾素(IFN)為德國Promocell產(chǎn)品；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3活性檢測試劑盒為碧云天產(chǎn)品；Lipofectamine2000為美國 Invitrogen產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人腎臟足細(xì)胞HPC用100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素、10%胎牛血清、10 U/ml重組γ-IFN的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：33℃，5%CO2培養(yǎng)箱。誘導(dǎo)分化條件為：37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞培養(yǎng)液中不添加重組γ-IFN，培養(yǎng)14 d后，分化成熟。實驗用足細(xì)胞均為分化成熟的足細(xì)胞。細(xì)胞傳代用含有0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液傳代。

1.3細(xì)胞分組 人腎臟足細(xì)胞HPC分為：Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR。其中HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG實驗時在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加30 mmol/L葡萄糖，Con、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR細(xì)胞實驗時在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加5.5 mmol/L葡萄糖，pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1所用細(xì)胞為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1后的足細(xì)胞，pcDNA3.1-VDR+HG、pcDNA3.1-VDR所用細(xì)胞為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VDR后的足細(xì)胞。人腎臟足細(xì)胞HPC培養(yǎng)密度約為60%時，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，步驟參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書。所有實驗用細(xì)胞在實驗開始前24 h分別用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液同步化處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，Con、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR細(xì)胞用qRT-PCR、Western印跡測定VDR mRNA和蛋白水平，步驟參照1.4和1.5。

1.4高糖作用后足細(xì)胞中VDR mRNA水平檢測 VDR mRNA表達(dá)水平用qRT-PCR測定。Con、HG細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后，提取細(xì)胞中總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測VDR mRNA。程序為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次。引物：VDR 上游：5′-TCCTTCCTCTGCTGGTAT-3′，下游5′-CTCCCTTGGTTAGTGTGGTAG-3′。β-actin上游：5′-CAGTGGGTTGGAGCGAGCAT-3′，下游5′-GGACTTCCTGTAACAACGCATCT-3′。2-△△Ct法計算VDR mRNA表達(dá)，β-actin為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.5高糖作用后足細(xì)胞中VDR 蛋白水平檢測 VDR蛋白水平用Western印跡法測定。Con、HG細(xì)胞培養(yǎng)24 h，提取細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法測定各組足細(xì)胞總蛋白濃度。用12%分離膠和5%濃縮膠電泳。將蛋白與同體積的上樣緩沖液在100℃孵育5 min。每個上樣孔添加40 μg蛋白樣品，80 V電壓在濃縮膠中電泳(約0.5 h)，120 V電壓在分離膠中電泳(約2 h)。90 V恒壓轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間約為1.5 h。把膜放在含有封閉液(5%牛血清白蛋白)中的薄膜袋，室溫孵育1 h。PBS加吐溫20(PBST)洗滌后，把膜放在含有稀釋好的一抗(VDR 1∶800稀釋，β-actin：1∶1 000稀釋)薄膜袋中，4℃過夜。PBST洗滌，把膜放在含有1∶3 000稀釋的二抗中，室溫孵育2 h。PBST洗滌，用ECL顯色。凝膠成像儀掃描圖像，用Image J分析各條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析VDR蛋白水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.6細(xì)胞凋亡測定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用Annexin V-FITC/PI雙染法測定細(xì)胞凋亡。收集各組細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，棄除上清，PBS洗滌2次細(xì)胞后，在細(xì)胞中加入Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液195 μl，混合均勻，再添加Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl，在室溫中孵育20 min，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況。

1.7Caspase-3活性測定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，用比色法測定細(xì)胞中Caspase-3的活性。收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min。取上清溶液，對蛋白進(jìn)行定量。在蛋白上清中添加入2×反應(yīng)緩沖液，再加入5 μl AC-DEVD-pNA，37℃孵育60 min。用酶標(biāo)儀測定405 nm的光密度(OD)值，以O(shè)D值表示Caspase-3的活性。

1.8STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白表達(dá)測定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞檢測STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平。STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平檢測用Western印跡法，步驟同1.5，其中一抗稀釋倍數(shù)為：STAT3(1∶600)、p-STAT3(1∶500)、p38(1∶600)、p-p38(1∶500)。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1高糖作用后足細(xì)胞中VDR的表達(dá) HG細(xì)胞中VDR mRNA和蛋白水平(0.51±0.06，0.38±0.04)與Con相比(1.00，1.12±0.13)明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中VDR的表達(dá) pcDNA3.1細(xì)胞中VDR mRNA和蛋白水平與Con相比沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。pcDNA3.1-VDR細(xì)胞中VDR mRNA和蛋白水平與Con相比明顯升高(P<0.05)。見圖2和表1。

圖1 Western印跡檢測高糖作用后足細(xì)胞中VDR的蛋白水平

表1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VDR后足細(xì)胞中VDR mRNA和蛋白水平

與Con相比：1)P<0.05

圖2 Western印跡檢測細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VDR后足細(xì)胞中VDR蛋白水平

2.3VDR對高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和Caspase-3活化的影響 HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細(xì)胞凋亡率明顯高于Con，細(xì)胞中Caspase-3活化水平也明顯高于Con(P<0.05)。pcDNA3.1-VDR+HG細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活化水平明顯低于HG(P<0.05)。見圖3和表2。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測定VDR對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡影響

表2 過表達(dá)VDR后經(jīng)高糖作用的足細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性

與Con相比：1)P<0.05；與HG相比：2)P<0.05；下表同

2.4VDR對高糖作用后足細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響 HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細(xì)胞中p-p38水平、p-STAT3水平明顯高于Con(P<0.05)。pcDNA3.1-VDR+HG細(xì)胞中p-p38水平、p-STAT3水平明顯低于HG(P<0.05)。見圖4和表3。

圖4 Western印跡測定VDR對高糖作用的足細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平影響

表3 VDR過表達(dá)后經(jīng)高糖作用足細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平

3 討 論

有研究報道，維生素D參與慢性腎臟病的發(fā)生和發(fā)展，維生素D的缺乏與糖尿病腎病的發(fā)生有關(guān)，慢性腎臟患者使用維生素D類的藥物可有效降低尿白蛋白肌酸酐比〔9,10〕。VDR屬于一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以特異性結(jié)合維生素D代謝產(chǎn)物，是維生素D的受體，其在腎臟組織中廣泛表達(dá)，腎小球上皮細(xì)胞、足細(xì)胞、腎小球旁器等中均發(fā)現(xiàn)有VDR的表達(dá)〔11,12〕。以前的研究報道，糖尿病小鼠VDR基因敲除后，小鼠產(chǎn)生的血管緊張素、腎素等異常增加，并且小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的腎組織損傷，伴隨有腎臟間質(zhì)纖維化、蛋白尿等癥狀，小鼠腎組織中足細(xì)胞大量凋亡〔7,13〕。本實驗說明VDR參與糖尿病腎病的發(fā)生，與上述實驗報道符合。

最初的研究顯示，腎小球肥大、系膜細(xì)胞增生、基底膜增厚等是糖尿病腎病早期的主要病理變化，然而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病的早期，足細(xì)胞數(shù)量異常減少，細(xì)胞間的間隙也不斷增加，并且在蛋白尿的發(fā)生中具有關(guān)鍵作用〔14〕。高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，足細(xì)胞在糖尿病腎病中凋亡異常增加。Caspase-3在正常狀態(tài)下以酶原的狀態(tài)廣泛存在于組織中，在受到細(xì)胞因子的作用后，細(xì)胞中Caspase-3活化，發(fā)揮凋亡促進(jìn)的作用〔15,16〕。本實驗結(jié)果說明VDR可以降低高糖對足細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

STAT3是STATs家族成員之一，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，STAT3磷酸化后形成二聚體進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，影響細(xì)胞的生長、凋亡等一系列過程〔17〕。STAT3在糖尿病腎病組織中磷酸化水平異常升高，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中STAT3磷酸化水平也異常升高〔18〕。p38是MAPK亞類之一，與糖尿病腎病的發(fā)生有關(guān)〔19〕。研究顯示，p38在糖尿病患者腎組織中的磷酸化水平升高，并且與糖尿病腎病腎組織中的細(xì)胞凋亡有關(guān)〔20〕。本實驗結(jié)果說明VDR對足細(xì)胞凋亡的影響與細(xì)胞中STAT3和p38磷酸化水平有關(guān)。綜上，高糖促進(jìn)足細(xì)胞中VDR的表達(dá)，并且VDR可以降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，STAT3和p38磷酸化水平的高低可能與VDR的作用機(jī)制有關(guān)。

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