NaCl鹽度對A2/O工藝去除廢水污染物和系統(tǒng)微生物的影響

張?zhí)m河，田 蕊，陳子成，郭靜波，賈艷萍

(1. 東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 吉林 132012；2. 東北電力大學(xué)建筑工程學(xué)院, 吉林 132012)

0 引 言

食品加工、皮革制造和海水淡化等行業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致了大量含鹽廢水產(chǎn)生[1]。這些含鹽廢水進(jìn)入城市污水處理廠與生化處理系統(tǒng)的活性污泥接觸后，將影響活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落組成、結(jié)構(gòu)和功能，活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落特性決定了污泥活性，從而導(dǎo)致有機(jī)物去除和脫氮效率的變化。因此，考察不同鹽度下微生物群落變化對提高污染物去除能力具有重要意義。

目前，許多學(xué)者研究了鹽度對生物反應(yīng)器（如序批式生物反應(yīng)器SBR、好氧生物處理反應(yīng)器ABR、浸沒式固定床生物反應(yīng)器SFBBR）活性污泥體系微生物群落特征的影響。王淑瑩等[2]采用3個平行的SBR處理實際含鹽生活污水，考察了NaCl鹽度對生物脫氮性能和微生物菌群的影響，結(jié)果表明鹽度對硝化菌的抑制作用遠(yuǎn)大于反硝化菌。李哲等[3]利用處理榨菜廢水（NaCl鹽度為21 g/L）的SBR研究了活性污泥沉降性能惡化的原因，發(fā)現(xiàn)是大量短桿狀、弧狀微生物群滋生附著于活性污泥表面所致。Abou-Elela等[4]發(fā)現(xiàn)在不同NaCl鹽度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%）下的SBR系統(tǒng)中，添加耐鹽木糖葡萄球菌有助于污泥在高鹽度下維持較高的COD去除率。Cortés-Lorenzo 等[5]研究了 NaCl鹽度（3.7、24.1、44.1 g/L）對氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)高鹽度導(dǎo)致與亞硝化螺旋菌相關(guān)的amoA序列消失，出現(xiàn)具有持久氨化作用的新種類微生物。

厭氧/缺氧/好氧工藝（A2/O）具有流程簡單和脫氮效果好的優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于污水處理中，通過厭氧、缺氧和好氧不同運行條件的變換達(dá)到同時去除有機(jī)物和脫氮的目的。含鹽廢水分別進(jìn)入?yún)捬鯀^(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)，并與這些區(qū)域的微生物發(fā)生作用并影響其特性，微生物特性的變化決定了脫氮效果的好壞。A2/O脫氮工藝中常見的微生物群落，如硝化菌為自養(yǎng)菌，具有好氧、代時長、生長慢、對環(huán)境條件敏感等特點[6]；反硝化菌為異養(yǎng)菌，具有缺氧、代時短、生長快等特點[7-8]。鹽類離子與硝化菌和反硝化菌發(fā)生作用，直接影響這些微生物的生長代謝和活性[9]。但是，關(guān)于不同鹽度下A2/O工藝厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)如何變化，以及鹽度影響有機(jī)物去除和脫氮作用的主要菌群及其分布規(guī)律尚不明確。

高通量測序是一種革命性的微生物生態(tài)學(xué)研究方法，可以對數(shù)百萬個DNA分子同時進(jìn)行測序[10]。其中擴(kuò)增子測序作為新一代測序方法具有讀長更長、周期更短的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域[11]。本研究分別提取 A2/O工藝不同區(qū)域的活性污泥總 DNA，并對其16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測序分析，研究不同鹽度下厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，同時結(jié)合有機(jī)物去除和脫氮效率的變化，探索含鹽廢水生物脫氮機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

活性污泥取自吉林市污水處理廠，利用A2/O反應(yīng)器（圖1）進(jìn)行污泥馴化。A2/O反應(yīng)器采用有機(jī)玻璃制成，有效容積為48 L，其中厭氧區(qū)、缺氧區(qū)有效容積均為12 L，好氧區(qū)有效容積為24 L，采用折流方式運行，豎流式二沉池容積為 5 L。污泥回流比為 50%，硝化液回流比為100%；污泥馴化達(dá)到穩(wěn)定后，MLSS為3 000-3 500 mg/L，HRT為8 h，溫度為20~23 ℃。實驗用水采用模擬城市污水，主要成分為：無水乙酸鈉(1.2 g/L)、氯化鈉(0～40 g/L)、氯化銨（0.25 g/L）、磷酸二氫鉀(0.05 g/L)、硫酸鎂(0.05 g/L)、氯化鈣(0.01 g/L)。以14 d作為一個運行周期，進(jìn)水NaCl鹽度分別為0、10和40 g/L。

圖1 A2/O工藝流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of A2/O technology process

1.2 微生物群落結(jié)構(gòu)測定與分析

1.2.1 樣品采集

反應(yīng)器穩(wěn)定運行后分析A2/O反應(yīng)器厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。在鹽度分別為 0、10和40 g/L的條件下，分別從厭氧區(qū)、缺氧區(qū)、好氧區(qū)取污泥樣品。其中，Y.0、Y.10、Y.40分別代表鹽度為 0、10和40 g/L時采集的厭氧區(qū)污泥樣品；Q.0、Q.10、Q.40分別代表鹽度為0、10和40 g/L時采集的缺氧區(qū)污泥樣品；H.0、H.10、H.40分別代表鹽度為0、10和40 g/L時采集的好氧區(qū)污泥樣品。

1.2.2 樣品測定

采用CTAB法提取活性污泥樣品中的DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度。以稀釋后的樣品基因組DNA作為模板，采用515F-806R對16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用Illumina Miseq平臺進(jìn)行測序。所用酶和緩沖液使用New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer；反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性1 min，然后30個循環(huán)（98 ℃變性 10 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s），最后72 ℃延伸5 min。利用New England Biolabs 公司的NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，再經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用HiSeq進(jìn)行上機(jī)測序，分析污泥樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用 Uparse（V7.0.1001）軟件進(jìn)行聚類分析；利用Qiime（V1.9.1）軟件計算 Chao1、ACE、Shannon、Simpson等指數(shù)[12]、Unifrac距離，構(gòu)建樣本聚類樹。

Chao1指數(shù)使用公式（1）計算

式中S1為Chao1指數(shù)；Sobs為測序分析得到的物種數(shù)；F1為樣本中數(shù)量為1的數(shù)目；F2為樣本中數(shù)量為2的數(shù)目。

ACE指數(shù)使用公式（2）、（3）計算：

式中SACE為ACE指數(shù)；Srare為含有“abund”條序列或少于“abund”條序列的OTU（optical transform unit）數(shù)目；ni為含有i條序列的OTU數(shù)目；Sabund為多于“abund”條序列的OTU數(shù)目；abund默認(rèn)為10。

Shannon指數(shù)使用公式（4）計算

式中H為Shannon指數(shù)；Pi為樣品中屬于第i種的個體的比例，下同。

Simpson指數(shù)使用公式（5）計算

式中D為Simposon指數(shù)；S為物種數(shù)目。

使用R（V2.15.3）軟件進(jìn)行Beta多樣性指數(shù)組間差異分析。

1.3 水質(zhì)分析項目和檢測方法

采用多參數(shù)水質(zhì)測定儀（連華科技，LH-3BA）測定COD、總氮（TN）和氨氮（NH4+-N）濃度，采用鹽酸-紫外分光光度法對硝態(tài)氮（NO3--N）進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對A2/O工藝污染物去除率的影響

不同鹽度下A2/O工藝污染物去除率的變化，如圖2所示。隨著NaCl鹽度的增大，厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)的COD去除率下降。當(dāng)鹽度為0時，厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)COD去除率分別為52%、80%和56%；當(dāng)鹽度為10 g/L時，各區(qū)域COD去除率分別為50%、76%和53%；當(dāng)鹽度為40 g/L時，各區(qū)域COD去除率為30%、50%和40%。隨著鹽度的升高，部分微生物因無法適應(yīng)鹽度環(huán)境而消失，導(dǎo)致污泥活性降低，COD去除率下降。

圖2b表明鹽度對A2/O工藝N去除的影響。隨著鹽度的增大，出水TN逐漸升高，TN去除率下降。厭氧區(qū)和好氧區(qū)主要進(jìn)行NH4+-N的去除，當(dāng)鹽度為0時，厭氧區(qū)和好氧區(qū)NH4+-N去除率分別為33%和61%；當(dāng)鹽度為10 g/L時，厭氧區(qū)和好氧區(qū)NH4+-N去除率分別為20%和57%；當(dāng)鹽度為40 g/L時，厭氧區(qū)和好氧區(qū)NH4+-N去除率分別為11%和39%。缺氧區(qū)主要進(jìn)行NO3--N的去除，隨著鹽度的增大，出水NO3--N升高。當(dāng)鹽度由0逐漸增大至10和40 g/L時，NO3--N去除率由63%下降至52%和47%。鹽度的增大對反硝化和硝化過程產(chǎn)生了抑制，出水NO3--N和NH4+-N均增加。厭氧區(qū)NH4+-N的去除主要供微生物細(xì)胞合成所需，不能適應(yīng)鹽度變化的微生物死亡使 NH4+-N需求量降低，導(dǎo)致厭氧區(qū)NH4+-N去除率下降[13]。同時，不能適應(yīng)新環(huán)境的硝化菌和反硝化菌數(shù)量的減少，也導(dǎo)致好氧區(qū)和缺氧區(qū)N利用率的降低。

圖2 鹽度對A2/O工藝不同區(qū)域COD和N濃度的影響Fig.2 Effect of salinity on COD and N concentration in different regions of A2/O technology process

2.2 鹽度對A2/O工藝微生物多樣性和差異性的影響

2.2.1 鹽度對微生物群落多樣性的影響

活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落豐富度和多樣性越高，污泥系統(tǒng)越穩(wěn)定，污染物去除率越高[14]。Alpha多樣性分析可以反映物種豐富度和群落多樣性。其中物種豐富度包括Chao指數(shù)與ACE指數(shù)，群落多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)。A2/O工藝厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)微生物多樣性的變化，如表1所示。與無NaCl的廢水相比，加入NaCl后：1）厭氧區(qū)Chao指數(shù)和ACE指數(shù)降低，群落豐富度降低；Shannon指數(shù)下降，群落多樣性降低；Simpson指數(shù)降低，該區(qū)域常見物種減少；2）缺氧區(qū)Chao指數(shù)和ACE指數(shù)在10 g/L時略有降低，在40 g/L時升高，群落豐富度增加；Shannon指數(shù)下降，群落多樣性降低；Simpson指數(shù)降低，該區(qū)域常見物種減少；3）好氧區(qū)Chao指數(shù)和ACE指數(shù)降低，群落豐富度降低；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在10 g/L時有所升高，在40 g/L時下降，群落多樣性降低、該區(qū)域常見物種減少。Guo和周貴忠等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度的不斷增加，微生物群落生長受到抑制，導(dǎo)致微生物多樣性逐漸降低，這與本研究結(jié)果基本一致。

表1 微生物多樣性的變化Table 1 Change of microbial diversity

2.2.2 鹽度對微生物群落差異性的影響

厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)微生物群落的差異，如圖3所示。Beta多樣性是通過比較不同生態(tài)系統(tǒng)間的多樣性反映單個樣品間是否存在顯著的群落差異[17-18]，應(yīng)用較多的是主坐標(biāo)分析（PCoA）和非度量多維尺度分析（NMDS），2點間距離越近，2個樣品的微生物群落差異越小。將所有活性污泥樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，中、低鹽度（<10 g/L）與高鹽度（40 g/L）的微生物群落分別位于左右兩側(cè)（圖 3），表明低鹽度微生物群落與高鹽度微生物群落的差異性顯著。

根據(jù)OTU聚類和微生物豐度對樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3c所示。依據(jù)進(jìn)水NaCl鹽度的不同，可分為高鹽度微生物群落與低鹽度微生物群落，高鹽度與低鹽度的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，低鹽度的微生物群落產(chǎn)生分支，這與Beta多樣性分析結(jié)果相一致。圖2污染物去除率的變化趨勢也與微生物群落的差異性一致，表明鹽度對污染物去除和微生物群落結(jié)構(gòu)差異具有顯著影響[19]。

圖3 A2/O工藝不同區(qū)域污泥微生物群落差異Fig.3 Differences of microbial communities in different regions of A2/O process

2.3 鹽度對A2/O工藝微生物群落分布的影響

2.3.1 門水平上微生物群落結(jié)構(gòu)

A2/O工藝不同區(qū)域活性污泥在門水平上的微生物群落相對豐度，如圖 4所示。在所有污泥樣品中，變形菌門均為優(yōu)勢菌門，相對豐度最高。Hu等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，采用A2/O工藝的污水處理廠中變形菌門是最優(yōu)勢菌門。隨著進(jìn)水NaCl鹽度的增大（由0升高至40 g/L），微生物多樣性降低，厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)中變形菌門的相對豐度均升高約10%，分別達(dá)到58%、49%和54%。綠彎菌門（兼性厭氧菌門）的相對豐度降低，厭氧區(qū)相對豐度由 23.4%下降至 9.3%，缺氧區(qū)相對豐度由15.7%下降至 14.8%，好氧區(qū)相對豐度由 13.3%下降至4.5%；綠彎菌門具有較強(qiáng)的污染物降解能力，其大部分菌屬是污泥絮體中的絲狀菌，是維持污泥形態(tài)的重要菌門之一[21-22]。擬桿菌門相對豐度逐漸降低，厭氧區(qū)相對豐度由17.9%下降至10.4%，缺氧區(qū)相對豐度由15.1%下降至8.6%，好氧區(qū)相對豐度由 19.7%下降至 12.7%，擬桿菌門是一種廣泛存在于污水環(huán)境中的菌門[23]。

圖4 門水平下物種相對豐度Fig.4 Relative abundances at phylum level

2.3.2 屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)

圖5為優(yōu)勢菌屬水平上的微生物群落分析。當(dāng)NaCl鹽度由 0增加至 40 g/L時，厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)Dechloromonas的相對豐度分別由6%、6%和7%增加至33%、17%和12%。當(dāng)NaCl鹽度為40 g/L時，該屬的相對豐度最高，成為優(yōu)勢菌屬。Dechloromonas在氮的轉(zhuǎn)化過程中起著一定作用，具有反硝化功能[24-25]。馮杲等[26]研究還發(fā)現(xiàn)，多數(shù)高氯酸鹽降解菌屬于Dechloromonas。隨著NaCl鹽度的逐漸增大，氯離子含量也逐漸增多，適應(yīng)新環(huán)境具有脫氯能力的 Dechloromonas相對豐度顯著增大。缺氧區(qū)的硝態(tài)氮主要通過反硝化過程去除。陶氏菌屬（Thauera）與副球菌屬（Paracocccus）為該區(qū)域中具有反硝化能力的優(yōu)勢菌屬[24]。當(dāng)NaCl鹽度為0時，陶氏菌屬和副球菌屬相對豐度分別為 2.7%和 0.67%；當(dāng)NaCl鹽度為10 g/L時，陶氏菌屬和副球菌屬相對豐度分別為2.4%和0.56%；當(dāng)NaCl鹽度為40 g/L時，陶氏菌屬和副球菌屬相對豐度分別為 2.5%和0.44%。結(jié)果表明，與無NaCl廢水相比，加入NaCl后，缺氧區(qū)陶氏菌屬和副球菌屬相對豐度下降，反硝化過程受到抑制，NO3--N去除率逐漸降低。

圖5 屬水平下物種相對豐度Fig.5 Relative abundances at genus level

好氧區(qū)氮的轉(zhuǎn)化包括氨化作用與硝化作用，梭菌屬（Clostridium）具有氨化作用，硝化螺旋菌（Nitrospirae）具有硝化作用。當(dāng)NaCl鹽度為0時，梭菌屬和硝化螺旋菌相對豐度分別為0.2%和0.14%；當(dāng)NaCl鹽度為10 g/L時，梭菌屬和硝化螺旋菌相對豐度分別為0.16%和0.02%；當(dāng)NaCl鹽度為40 g/L時，梭菌屬和硝化螺旋菌相對豐度分別為 0.1%和 0.1%。與無 NaCl廢水相比，加入 NaCl后，好氧區(qū)梭菌屬和硝化螺旋菌相對豐度降低，氨化作用和硝化作用均減弱，NH4+-N去除率下降。

通過對優(yōu)勢菌的分析表明，隨著鹽度的增大，變形桿菌門中Dechloromonas相對豐度增加；但是，脫氮能力強(qiáng)的陶氏菌屬和副球菌屬、具有氨化作用的梭菌屬和硝化作用的硝化螺旋菌相對豐度降低，這是導(dǎo)致A2/O工藝脫氮效率下降的主要因素。

2.3.3 屬水平上微生物群落聚類分析

圖 6為屬水平上的微生物聚類圖。微生物聚類圖可直觀地表現(xiàn)各菌屬相對豐度的高低，便于發(fā)現(xiàn)各區(qū)域獨特的優(yōu)勢菌屬。隨著NaCl鹽度增大，厭氧區(qū)的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）相對豐度增大；缺氧區(qū)的Tepidibacterium和Veillonella相對豐度增大；好氧區(qū)的Lachnoclostridium和Zoogloea相對豐度逐漸增大，這 6種菌屬均屬于厚壁菌門。很多厚壁菌門產(chǎn)生芽孢，能夠抵抗高鹽極端環(huán)境，在鹽堿地、海洋和湖泊污泥中也發(fā)現(xiàn)了大量厚壁菌門的耐鹽微生物[27-28]。

圖6 屬水平下微生物聚類圖Fig.6 Microbial cluster graph at genus level

綜合以上結(jié)果可知，不同鹽度下A2/O工藝各區(qū)域微生物群落結(jié)構(gòu)的變化能夠反映污染物去除率的變化，通過監(jiān)測微生物的多樣性、差異性和群落分布，及時調(diào)整工藝運行參數(shù)，有利于提高脫氮效率。同時，反硝化菌比硝化菌具有更強(qiáng)的耐鹽性，加強(qiáng)硝化菌的馴化有利于提高脫氮效率；在厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)發(fā)現(xiàn)了一些具有耐鹽性的細(xì)菌（如Lactobacillus、Tepidibacterium和Lachnoclostridium等），對這些細(xì)菌進(jìn)行富集和篩選，對提高污染物去除率也有積極意義。

3 結(jié) 論

1）鹽度的增加降低了微生物的豐富度和多樣性，導(dǎo)致A2/O工藝污染物去除率下降。當(dāng)鹽度由0增大至40 g/L時：A2/O反應(yīng)器厭氧、缺氧和好氧區(qū)域 COD去除率分別由52%、80%和56%下降至30%、50%和40%；厭氧區(qū)和好氧區(qū)NH4+-N去除率分別由33%和61%下降至11%和39%；缺氧區(qū)NO3--N去除率由63%下降至47%。

2）低鹽度微生物群落與高鹽度微生物群落的差異性顯著。變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠菌門（Chlorobi）始終是 A2/O工藝厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)的微生物優(yōu)勢菌門，保證了A2/O工藝在含鹽環(huán)境中具有降解有機(jī)物與脫氮的能力。

3）隨著NaCl鹽度的增大，Dechloromonas成為厭氧區(qū)、缺氧區(qū)和好氧區(qū)的優(yōu)勢菌屬；缺氧區(qū)活性污泥中陶氏菌屬（Thauera）和副球菌屬（Paracocccus）、好氧區(qū)活性污泥中梭菌屬（Clostridium）和硝化螺旋菌（Nitrospirae）相對豐度的降低是導(dǎo)致 A2/O工藝脫氮性能降低的主要原因。

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