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    銀杏花粉黃酮組分分離純化及其清除DPPH自由基能力

    2018-06-05 06:55:20裘紀(jì)瑩陳相艷閆慧嬌王岱杰陳蕾蕾
    關(guān)鍵詞:粗提物乙酸乙酯銀杏

    裘紀(jì)瑩,陳相艷,閆慧嬌,王岱杰,陳蕾蕾※

    (1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250100;2. 山東省分析測(cè)試中心/山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250014)

    0 引 言

    銀杏花粉是銀杏(Ginkgo biloba L.)雄株的花粉,富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,最新研究顯示,銀杏花粉中24種游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.316 mg/g,鉀離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá) 26.301 mg/g[1]。同時(shí),銀杏花粉含有黃酮、萜內(nèi)酯、多糖等活性成分[2-3],黃酮類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為 21.4 mg/g[4]。而且,銀杏花粉對(duì)小鼠沒(méi)有急性毒性作用,安全性高并且具有潛在的免疫增強(qiáng)作用[5]。所以,銀杏花粉具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

    目前對(duì)銀杏花粉的研究主要參考銀杏葉的研究成果。銀杏葉的主要藥效成分為黃酮類和萜內(nèi)酯類化合物[6-7],故學(xué)者對(duì)銀杏花粉的黃酮和內(nèi)酯含量進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)方法和指標(biāo)也參考了銀杏葉的方法[8]。銀杏花粉的總黃酮含量高,黃酮苷元主要為山奈酚,而銀杏葉黃酮苷元主要為槲皮素,這意味著銀杏花粉的黃酮成分和銀杏葉有較大差異。然而,由于目前銀杏花粉的化學(xué)成分研究還處于起步階段,在分析銀杏花粉黃酮組分時(shí)往往參考銀杏葉的研究成果,如文獻(xiàn)報(bào)道蘆丁在銀杏葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)2 200 μg/g[9],所以徐澄梅等[10]對(duì)銀杏花粉的蘆丁進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示蘆丁在銀杏花粉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為120.9 μg/g,不到銀杏葉的6%。因此,通過(guò)參考銀杏葉的主要黃酮組分來(lái)研究銀杏花粉黃酮的意義不大,有必要對(duì)銀杏花粉的黃酮類化合物進(jìn)行系統(tǒng)地分離純化。

    基于DPPH-HPLC-DAD/PAD的液相色譜分析技術(shù)是一種從復(fù)雜樣品中快速篩選抗氧化組分的檢測(cè)技術(shù),在中國(guó)植物、中藥等的抗氧化物質(zhì)快速篩選和鑒定方面有廣泛應(yīng)用[11]。制備型液相色譜技術(shù)是目前發(fā)展迅速的一種快速分離純化技術(shù),該技術(shù)在分析型高效液相色譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái),具有上樣量大,分離度和靈敏度高,分離速度快和目標(biāo)化合物純度高等特點(diǎn),是實(shí)驗(yàn)室分離純化未知化學(xué)組分的優(yōu)選手段[12]。將 DPPH-HPLCDAD/PAD篩選技術(shù)和制備型液相色譜制備技術(shù)結(jié)合使用,有利于針對(duì)性地分離純化出具有潛在抗氧化活性的黃酮組分。

    本文首先對(duì)銀杏花粉的總黃酮進(jìn)行提取和分步萃取,并通過(guò) DPPH自由基清除能力檢測(cè)和組分分析鎖定擬進(jìn)一步分離純化的萃取相。然后通過(guò)DPPH-HPLC-PAD技術(shù)對(duì)萃取相進(jìn)行潛在抗氧化活性組分的篩選,并采用制備型液相色譜技術(shù)分離純化這些目標(biāo)組分,并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。最后初步研究了分離組分的清除 DPPH自由基能力,以期為銀杏花粉功能成分的深入研究奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    銀杏花粉:采自山東郯城,選取3棵100 a左右樹(shù)齡的銀杏雄樹(shù),在花穗成熟前3~5 d采集花穗。20 ℃干燥2~3 d,每天翻動(dòng)2~3次?;ǚ弁耆⒊龊筮^(guò)100目篩,過(guò)篩花粉收集后置于干燥容器中-20℃冷凍密封保存;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)購(gòu)于美國(guó) Sigma-Aldrich 公司;山奈酚對(duì)照品(純度≥98%),購(gòu)于山東省中藥化學(xué)對(duì)照品/標(biāo)準(zhǔn)品工程技術(shù)研究中心;乙腈為色譜純,甲醇、無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、冰醋酸均為分析純。

    XO-SM100超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng),南京先歐儀器制造有限公司;Mettler AE240電子分析天平,精確到0.000 1 g,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī),日本日立公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司;LC-6AD制備色譜儀,美國(guó) Shimadzu公司;Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó) Agilent公司;Varian-600兆核磁共振儀,美國(guó) Varian公司;Milli-Q Academic超純水系統(tǒng),電阻率18.2 M?,美國(guó)Millipore公司;R-230旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士Buchi公司;UV-160型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 銀杏花粉黃酮的提取和分步萃取

    采用微波法進(jìn)行提取[13],提取液于13 000 r/min離心10 min,收集上清液后抽濾2次,濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醇并濃縮,然后冷凍干燥得到銀杏花粉黃酮粗提物。該粗提物采用適量蒸餾水分散,并依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次,合并3次萃取液,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得銀杏花粉黃酮石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物。

    1.2.2 DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)

    測(cè)定方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[13],根據(jù)結(jié)果計(jì)算樣品的DPPH清除率和半抑制率(IC50值)[14]。

    1.2.3 銀杏花粉黃酮粗提物和萃取相的組分分析及清除DPPH自由基組分篩選

    取銀杏花粉黃酮粗提物及石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物,采用分析型高效液相色譜(Agilent 1 260,HPLC)進(jìn)行組分分析,分析柱采用Agilent SB-C18 柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm),設(shè)定柱溫30 ℃,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm,上樣量10 μL。液相色譜梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

    表1 分析型液相色譜流動(dòng)相條件Table 1 Mobile phase conditions of analytical high performance liquid chromatography (HPLC)

    清除 DPPH自由基黃酮的篩選采用 DPPH-HPLCPAD法[15],將待篩選樣品與 DPPH試劑按體積比1:1進(jìn)行混合、常溫避光反應(yīng)30 min后進(jìn)行液相色譜檢測(cè),以甲醇代替 DPPH試劑作為反應(yīng)前對(duì)照。液相色譜檢測(cè)條件參照組分分析條件。

    1.2.4 銀杏花粉中清除DPPH自由基黃酮的分離純化

    采用制備型液相色譜技術(shù)(Shimadzu LC-6AD)對(duì)銀杏花粉乙酸乙酯相萃取物進(jìn)行分離純化。制備柱采用YMC-C18柱(10 mm × 250 mm,5 μm),流速 3 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm,樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣300 μL,流動(dòng)相條件見(jiàn)表2。

    表2 制備型液相色譜流動(dòng)相條件Table 2 Mobile phase conditions of preparative HPLC

    1.2.5 分離組分的純度檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定

    采用液相色譜面積歸一法進(jìn)行純度檢測(cè)[16];采用紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜等進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè)[17-18],并通過(guò)結(jié)構(gòu)解析、文獻(xiàn)對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照等確定分離組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由 3 組平行取平均值計(jì)算得到,數(shù)據(jù)處理和方差分析使用SPSS 19軟件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 銀杏花粉黃酮的提取、分步萃取及DPPH清除能力分析

    為了針對(duì)性地分離純化具有潛在抗氧化活性的銀杏花粉黃酮,對(duì)銀杏花粉粗提物及石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物進(jìn)行了 DPPH清除率測(cè)定,并計(jì)算其對(duì)DPPH的半抑制率(IC50值)。IC50值越低,說(shuō)明該部位清除 DPPH的活性越高。結(jié)果顯示,上述樣品間IC50值具有極顯著性差異(P<0.01)。銀杏花粉粗提物的IC50值為1.32 mg/mL,乙酸乙酯相、正丁醇相的IC50值為0.46、0.84 mg/mL,分別是粗提物IC50值的34.85%和63.64%。水相的IC50值略高于粗提物,為1.61 mg/mL,石油醚相的IC50值最高,超過(guò)2.00 mg/mL??梢?jiàn),銀杏花粉粗提物具有清除 DPPH活性,并且通過(guò)分步萃取,清除DPPH活性組分在乙酸乙酯相和正丁醇相得到富集,其中乙酸乙酯相的清除DPPH活性最高。

    在此基礎(chǔ)上建立分析型高效液相色譜檢測(cè)銀杏花粉黃酮的方法,并檢測(cè)其在乙酸乙酯相和正丁醇相中的富集情況,結(jié)果見(jiàn)圖1。以銀杏花粉粗提物中6個(gè)色譜峰各自的峰面積為“1”,計(jì)算乙酸乙酯相和正丁醇相相應(yīng)化合物的相對(duì)峰面積,結(jié)果見(jiàn)表3。

    圖1 銀杏花粉粗提物、乙酸乙酯相和正丁醇相的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of crude extract, ethyl acetate phase extract, and butanol phase extract of Ginkgo biloba pollen

    表3 銀杏花粉粗提物、乙酸乙酯相和正丁醇相中化合物1~6的相對(duì)峰面積Table 3 Relative peak areas of compounds 1~6 in the crude extract, ethyl acetate phase extract, and butanol phase extract of Ginkgo biloba pollen

    由圖1和表3可知,銀杏花粉粗提物的主要檢出峰為化合物 1、2、3、4,這些化合物是后續(xù)分離純化的重點(diǎn)目標(biāo)物質(zhì),化合物5、6在粗提物中的含量較低。分步萃取后,在正丁醇相中化合物 1、2、6得到富集,但化合物3、4、5被大量稀釋;而在乙酸乙酯相中化合物2、3、4、5、6均得到富集,尤其是化合物3、4在乙酸乙酯相分別被富集了24.68和12.52倍,化合物1在乙酸乙酯相雖未被富集,但能夠達(dá)到下一步分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定的基本要求。可見(jiàn),乙酸乙酯相富集了分離純化的主要目標(biāo)物質(zhì),后續(xù)以乙酸乙酯萃取物為原料進(jìn)行清除DPPH黃酮的篩選、分離和純化。

    采用DPPH-HPLC-PAD法對(duì)銀杏花粉乙酸乙酯萃取物進(jìn)行清除 DPPH自由基活性組分的快速篩選,結(jié)果見(jiàn)圖2。與DPPH試劑反應(yīng)后,化合物1~6的峰面積均有所下降,故這6個(gè)化合物均具有清除DPPH自由基的能力。后續(xù)對(duì)這 6個(gè)色譜峰進(jìn)行制備型液相色譜的分離純化。

    圖2 銀杏花粉乙酸乙酯萃取物與DPPH反應(yīng)前后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of Ginkgo biloba pollen (GP) ethyl acetate phase extract based upon DPPH elimination detection.

    2.2 利用制備型液相色譜分離純化銀杏花粉中清除DPPH自由基黃酮組分

    由于銀杏花粉粗提物的成分復(fù)雜,采用液相色譜進(jìn)行組分分析和清除 DPPH自由基黃酮組分篩選時(shí)的液相色譜條件主要考慮組分間的分離度,所需的分析時(shí)間較長(zhǎng)。而乙酸乙酯相樣品雜質(zhì)較少,為了提高制備效率,減少流動(dòng)相用量及縮短制備周期,對(duì)制備型液相色譜的流動(dòng)相梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)表2,乙酸乙酯相的分離效果見(jiàn)圖3。

    圖3 化合物1~6的制備型液相色譜圖Fig.3 Isolation and purification of compounds 1 to 6 by preparative liquid chromatography

    由圖3可見(jiàn),化合物1~6在30 min內(nèi)得到良好分離,在保證純度的同時(shí)大大縮短了制備所需時(shí)間。通過(guò)色譜分離后,分別收集色譜峰1~6的洗脫液,采用水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈,冷凍干燥后分別得到化合物1(25.0 mg,純度>98.0%)、化合物2(8.6 mg,純度≈85.7%)、化合物3(16.9 mg,純度≈95.9%)、化合物4(15.1 mg,純度>98.0%)、化合物5(13.4 mg,純度>98.0%)和化合物6(9.16 mg,純度>98.0%)。這些目標(biāo)組分的質(zhì)量和純度滿足下一步結(jié)構(gòu)鑒定的要求。

    2.3 銀杏花粉清除DPPH自由基黃酮組分的結(jié)構(gòu)鑒定

    利用紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜等技術(shù),鑒定得到了化合物1~6的化學(xué)結(jié)構(gòu),結(jié)果如下:化合物1的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)(λmax)在265、340 nm,由電噴霧電離質(zhì)譜(Electrospray Ionization Mass Spectrometry,ESI-MS)測(cè)定質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio,m/z)為609.1425 [M-H]-、611.1615 [M+H]+,推測(cè)分子式為C27H30O16,核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)顯示其黃酮醇信號(hào)及2個(gè)β-D-葡萄糖信號(hào),與6.23(1H, d, J = 1.8 Hz, H-6),6.47 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8)為 A環(huán)間位偶合信號(hào),8.13 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2’, 6’)、7.16(2H, d, J = 9.0 Hz, H-3’, 5’)顯示B環(huán)對(duì)位取代,與化合物3比較,B環(huán)數(shù)據(jù)受苷化影響,推測(cè)4’位成苷。其紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振數(shù)據(jù)與 Cui等[19]的報(bào)道基本一致,故鑒定化合物1為山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷?;衔?的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)(λmax)在264、314 nm,由 ESI-MS (m/z) 593.1461 [M-H]-、595.1658[M+H]+,推測(cè)分子式為 C27H30O15,NMR顯示其黃酮醇信號(hào)、1個(gè)β-D-葡萄糖信號(hào)及1個(gè)α-L-鼠李糖信號(hào),其紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振數(shù)據(jù)與Kang[20]基本一致,故鑒定化合物 2為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷。化合物 3的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)(λmax)在 265、349 nm,由 ESI-MS (m/z) 447.0879 [M-H]-、449.1077 [M+H]+,推測(cè)分子式為C21H20O11,NMR顯示其黃酮醇信號(hào)及1個(gè)β-D-葡萄糖信號(hào),6.21 (1H, d, J =1.8 Hz,H-6)、6.44 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8)為A環(huán)間位偶合信號(hào),8.04 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2’, 6’)、6.89 (2H, d, J = 9.0 Hz,H-3’, 5’)顯示為B環(huán)對(duì)位取代,以上數(shù)據(jù)與Kishore[21]基本一致,故鑒定化合物 3為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。化合物4的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)(λmax)在264、341 nm,ESI-MS (m/z) 431.0926 [M-H]-、433.1141[M+H]+,推測(cè)分子式為 C21H20O10,NMR顯示其黃酮醇信號(hào)及1個(gè)α-L-鼠李糖信號(hào)。1H NMR顯示A環(huán)間位偶合信號(hào),B環(huán)對(duì)位取代信號(hào),由13C NMR苷元苷化位移符合3位成苷特征,通過(guò)與Hegazi[22]的報(bào)道對(duì)比發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物4為山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。化合物5的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)(λmax)在213、289 nm,ESI-MS (m/z) 271.0673 [M-H]-、273.0754[M+H]+,推測(cè)分子式為C15H12O5,NMR譜中5.44 (1H, dd,J = 13.2, 3.0 Hz, H-2)、3.28 (1H, dd, J = 17.1, 13.2 Hz,H-3a)、2.68 (1H, dd, J = 17.1, 3.0 Hz, H-3b)及 78.6 (C-2)、42.4 (C-3)顯示其為二氫黃酮類化合物,通過(guò)與陳胡蘭等[23-24]的報(bào)道比對(duì),鑒定化合物5為柚皮素。化合物6的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)(λmax)在266、368 nm,ESI-MS (m/z) 285.0340 [M-H]-、287.055 2 [M+H]+,推測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為286.0,分子式為C15H10O6,與山奈酚的分子量一致[25],由于王國(guó)霞等[8]的研究顯示銀杏花粉的主要黃酮苷元為山奈酚,故化合物 6為山奈酚的可能性較大。將化合物 6與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較,其高效液相色譜的出峰保留時(shí)間一致,故鑒定化合物 6為山奈酚?;衔?~6的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

    圖4 化合物1~6的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structures of compounds 1 to 6

    將純化得到的 6種化合物重新混合制成標(biāo)準(zhǔn)品,并進(jìn)行液相色譜分析,結(jié)果見(jiàn)圖5,通過(guò)與圖1a以及圖2的出峰時(shí)間相比較,發(fā)現(xiàn)這 6種化合物與銀杏花粉粗提物的6種主成分以及乙酸乙酯相的6種主要清除DPPH自由基活性物質(zhì)的出峰保留時(shí)間一致。可見(jiàn)這 6種化合物即為銀杏花粉的主要清除DPPH自由基黃酮組分。

    圖5 化合物1~6的混合標(biāo)準(zhǔn)品Fig.5 Mixed standards of compounds 1 to 6

    2.4 純化黃酮單體的DPPH清除能力

    以維生素C和蘆丁為對(duì)照,測(cè)定化合物1、2、3、4、5、6的DPPH清除率并計(jì)算IC50值。維生素C和蘆丁的IC50值分別為0.013和0.014 mg/mL,山奈酚(6)的IC50值為0.017 mg/mL,與維生素C和蘆丁相比均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)和山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷(1)均為以山奈酚為母核的黃酮苷,其 IC50值均高于山奈酚,分別為0.210、1.530、1.730和2.250 mg/mL。柚皮素(5)的IC50值最高,超過(guò)2.500 mg/mL??梢?jiàn),上述化合物清除DPPH自由基的活性由高到低依次為:化合物6>化合物 2>化合物3>化合物 4>化合物 1>化合物 5。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,山奈酚廣泛存在于植物花粉及蜂花粉中[26-27],多數(shù)以結(jié)合態(tài)的形式存在[28],具有較好的清除自由基和防止脂質(zhì)過(guò)氧化等抗氧化作用[29-30],與本研究結(jié)果一致。

    3 結(jié) 論

    1)銀杏花粉粗提物具有清除DPPH自由基活性,對(duì)DPPH的半抑制率為1.32 mg/mL,乙酸乙酯相和正丁醇相對(duì)DPPH的半抑制率為0.46和0.84 mg/mL,分別是粗提物的34.85%和63.64%,乙酸乙酯相的清除DPPH活性最高。

    2)乙酸乙酯相富集了6種主要銀杏花粉黃酮,而且均具有清除DPPH活性。

    3)采用制備型液相色譜進(jìn)行分離純化,經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為:山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷(1)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(2)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(3)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)、柚皮素(5)和山奈酚(6),其中山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷(1)和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷(2)是首次從銀杏中純化得到。

    4)純化產(chǎn)物清除DPPH自由基的活性由高到低依次為:化合物 6>化合物 2>化合物 3>化合物 4>化合物1>化合物5。其中山奈酚(6)清除DPPH的IC50值為0.017 mg/mL,與維生素C及蘆丁相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

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