銀杏花粉黃酮組分分離純化及其清除DPPH自由基能力

裘紀(jì)瑩，陳相艷，閆慧嬌，王岱杰，陳蕾蕾※

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2. 山東省分析測(cè)試中心/山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014）

0 引 言

銀杏花粉是銀杏（Ginkgo biloba L.）雄株的花粉，富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，最新研究顯示，銀杏花粉中24種游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為62.316 mg/g，鉀離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá) 26.301 mg/g[1]。同時(shí)，銀杏花粉含有黃酮、萜內(nèi)酯、多糖等活性成分[2-3]，黃酮類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為 21.4 mg/g[4]。而且，銀杏花粉對(duì)小鼠沒(méi)有急性毒性作用，安全性高并且具有潛在的免疫增強(qiáng)作用[5]。所以，銀杏花粉具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

目前對(duì)銀杏花粉的研究主要參考銀杏葉的研究成果。銀杏葉的主要藥效成分為黃酮類和萜內(nèi)酯類化合物[6-7]，故學(xué)者對(duì)銀杏花粉的黃酮和內(nèi)酯含量進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)方法和指標(biāo)也參考了銀杏葉的方法[8]。銀杏花粉的總黃酮含量高，黃酮苷元主要為山奈酚，而銀杏葉黃酮苷元主要為槲皮素，這意味著銀杏花粉的黃酮成分和銀杏葉有較大差異。然而，由于目前銀杏花粉的化學(xué)成分研究還處于起步階段，在分析銀杏花粉黃酮組分時(shí)往往參考銀杏葉的研究成果，如文獻(xiàn)報(bào)道蘆丁在銀杏葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)2 200 μg/g[9]，所以徐澄梅等[10]對(duì)銀杏花粉的蘆丁進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示蘆丁在銀杏花粉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為120.9 μg/g，不到銀杏葉的6%。因此，通過(guò)參考銀杏葉的主要黃酮組分來(lái)研究銀杏花粉黃酮的意義不大，有必要對(duì)銀杏花粉的黃酮類化合物進(jìn)行系統(tǒng)地分離純化。

基于DPPH-HPLC-DAD/PAD的液相色譜分析技術(shù)是一種從復(fù)雜樣品中快速篩選抗氧化組分的檢測(cè)技術(shù)，在中國(guó)植物、中藥等的抗氧化物質(zhì)快速篩選和鑒定方面有廣泛應(yīng)用[11]。制備型液相色譜技術(shù)是目前發(fā)展迅速的一種快速分離純化技術(shù)，該技術(shù)在分析型高效液相色譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，具有上樣量大，分離度和靈敏度高，分離速度快和目標(biāo)化合物純度高等特點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室分離純化未知化學(xué)組分的優(yōu)選手段[12]。將 DPPH-HPLCDAD/PAD篩選技術(shù)和制備型液相色譜制備技術(shù)結(jié)合使用，有利于針對(duì)性地分離純化出具有潛在抗氧化活性的黃酮組分。

本文首先對(duì)銀杏花粉的總黃酮進(jìn)行提取和分步萃取，并通過(guò) DPPH自由基清除能力檢測(cè)和組分分析鎖定擬進(jìn)一步分離純化的萃取相。然后通過(guò)DPPH-HPLC-PAD技術(shù)對(duì)萃取相進(jìn)行潛在抗氧化活性組分的篩選，并采用制備型液相色譜技術(shù)分離純化這些目標(biāo)組分，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。最后初步研究了分離組分的清除 DPPH自由基能力，以期為銀杏花粉功能成分的深入研究奠定扎實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏花粉：采自山東郯城，選取3棵100 a左右樹(shù)齡的銀杏雄樹(shù)，在花穗成熟前3～5 d采集花穗。20 ℃干燥2～3 d，每天翻動(dòng)2～3次?；ǚ弁耆⒊龊筮^(guò)100目篩，過(guò)篩花粉收集后置于干燥容器中-20℃冷凍密封保存；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）購(gòu)于美國(guó) Sigma-Aldrich 公司；山奈酚對(duì)照品（純度≥98%），購(gòu)于山東省中藥化學(xué)對(duì)照品/標(biāo)準(zhǔn)品工程技術(shù)研究中心；乙腈為色譜純，甲醇、無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、冰醋酸均為分析純。

XO-SM100超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐儀器制造有限公司；Mettler AE240電子分析天平，精確到0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；LC-6AD制備色譜儀，美國(guó) Shimadzu公司；Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó) Agilent公司；Varian-600兆核磁共振儀，美國(guó) Varian公司；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)，電阻率18.2 M?，美國(guó)Millipore公司；R-230旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；UV-160型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏花粉黃酮的提取和分步萃取

采用微波法進(jìn)行提取[13]，提取液于13 000 r/min離心10 min，收集上清液后抽濾2次，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醇并濃縮，然后冷凍干燥得到銀杏花粉黃酮粗提物。該粗提物采用適量蒸餾水分散，并依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，合并3次萃取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得銀杏花粉黃酮石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物。

1.2.2 DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[13]，根據(jù)結(jié)果計(jì)算樣品的DPPH清除率和半抑制率（IC50值）[14]。

1.2.3 銀杏花粉黃酮粗提物和萃取相的組分分析及清除DPPH自由基組分篩選

取銀杏花粉黃酮粗提物及石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物，采用分析型高效液相色譜（Agilent 1 260，HPLC）進(jìn)行組分分析，分析柱采用Agilent SB-C18 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），設(shè)定柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，上樣量10 μL。液相色譜梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 分析型液相色譜流動(dòng)相條件Table 1 Mobile phase conditions of analytical high performance liquid chromatography (HPLC)

清除 DPPH自由基黃酮的篩選采用 DPPH-HPLCPAD法[15]，將待篩選樣品與 DPPH試劑按體積比1:1進(jìn)行混合、常溫避光反應(yīng)30 min后進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，以甲醇代替 DPPH試劑作為反應(yīng)前對(duì)照。液相色譜檢測(cè)條件參照組分分析條件。

1.2.4 銀杏花粉中清除DPPH自由基黃酮的分離純化

采用制備型液相色譜技術(shù)（Shimadzu LC-6AD）對(duì)銀杏花粉乙酸乙酯相萃取物進(jìn)行分離純化。制備柱采用YMC-C18柱（10 mm × 250 mm，5 μm），流速 3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣300 μL，流動(dòng)相條件見(jiàn)表2。

表2 制備型液相色譜流動(dòng)相條件Table 2 Mobile phase conditions of preparative HPLC

1.2.5 分離組分的純度檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定

采用液相色譜面積歸一法進(jìn)行純度檢測(cè)[16]；采用紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜等進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè)[17-18]，并通過(guò)結(jié)構(gòu)解析、文獻(xiàn)對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照等確定分離組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由 3 組平行取平均值計(jì)算得到，數(shù)據(jù)處理和方差分析使用SPSS 19軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏花粉黃酮的提取、分步萃取及DPPH清除能力分析

為了針對(duì)性地分離純化具有潛在抗氧化活性的銀杏花粉黃酮，對(duì)銀杏花粉粗提物及石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相萃取物進(jìn)行了 DPPH清除率測(cè)定，并計(jì)算其對(duì)DPPH的半抑制率（IC50值）。IC50值越低，說(shuō)明該部位清除 DPPH的活性越高。結(jié)果顯示，上述樣品間IC50值具有極顯著性差異（P＜0.01）。銀杏花粉粗提物的IC50值為1.32 mg/mL，乙酸乙酯相、正丁醇相的IC50值為0.46、0.84 mg/mL，分別是粗提物IC50值的34.85%和63.64%。水相的IC50值略高于粗提物，為1.61 mg/mL，石油醚相的IC50值最高，超過(guò)2.00 mg/mL?？梢?jiàn)，銀杏花粉粗提物具有清除 DPPH活性，并且通過(guò)分步萃取，清除DPPH活性組分在乙酸乙酯相和正丁醇相得到富集，其中乙酸乙酯相的清除DPPH活性最高。

在此基礎(chǔ)上建立分析型高效液相色譜檢測(cè)銀杏花粉黃酮的方法，并檢測(cè)其在乙酸乙酯相和正丁醇相中的富集情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。以銀杏花粉粗提物中6個(gè)色譜峰各自的峰面積為“1”，計(jì)算乙酸乙酯相和正丁醇相相應(yīng)化合物的相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 銀杏花粉粗提物、乙酸乙酯相和正丁醇相的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of crude extract, ethyl acetate phase extract, and butanol phase extract of Ginkgo biloba pollen

表3 銀杏花粉粗提物、乙酸乙酯相和正丁醇相中化合物1～6的相對(duì)峰面積Table 3 Relative peak areas of compounds 1～6 in the crude extract, ethyl acetate phase extract, and butanol phase extract of Ginkgo biloba pollen

由圖1和表3可知，銀杏花粉粗提物的主要檢出峰為化合物 1、2、3、4，這些化合物是后續(xù)分離純化的重點(diǎn)目標(biāo)物質(zhì)，化合物5、6在粗提物中的含量較低。分步萃取后，在正丁醇相中化合物 1、2、6得到富集，但化合物3、4、5被大量稀釋；而在乙酸乙酯相中化合物2、3、4、5、6均得到富集，尤其是化合物3、4在乙酸乙酯相分別被富集了24.68和12.52倍，化合物1在乙酸乙酯相雖未被富集，但能夠達(dá)到下一步分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定的基本要求。可見(jiàn)，乙酸乙酯相富集了分離純化的主要目標(biāo)物質(zhì)，后續(xù)以乙酸乙酯萃取物為原料進(jìn)行清除DPPH黃酮的篩選、分離和純化。

采用DPPH-HPLC-PAD法對(duì)銀杏花粉乙酸乙酯萃取物進(jìn)行清除 DPPH自由基活性組分的快速篩選，結(jié)果見(jiàn)圖2。與DPPH試劑反應(yīng)后，化合物1～6的峰面積均有所下降，故這6個(gè)化合物均具有清除DPPH自由基的能力。后續(xù)對(duì)這 6個(gè)色譜峰進(jìn)行制備型液相色譜的分離純化。

圖2 銀杏花粉乙酸乙酯萃取物與DPPH反應(yīng)前后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of Ginkgo biloba pollen (GP) ethyl acetate phase extract based upon DPPH elimination detection.

2.2 利用制備型液相色譜分離純化銀杏花粉中清除DPPH自由基黃酮組分

由于銀杏花粉粗提物的成分復(fù)雜，采用液相色譜進(jìn)行組分分析和清除 DPPH自由基黃酮組分篩選時(shí)的液相色譜條件主要考慮組分間的分離度，所需的分析時(shí)間較長(zhǎng)。而乙酸乙酯相樣品雜質(zhì)較少，為了提高制備效率，減少流動(dòng)相用量及縮短制備周期，對(duì)制備型液相色譜的流動(dòng)相梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2，乙酸乙酯相的分離效果見(jiàn)圖3。

圖3 化合物1～6的制備型液相色譜圖Fig.3 Isolation and purification of compounds 1 to 6 by preparative liquid chromatography

由圖3可見(jiàn)，化合物1～6在30 min內(nèi)得到良好分離，在保證純度的同時(shí)大大縮短了制備所需時(shí)間。通過(guò)色譜分離后，分別收集色譜峰1～6的洗脫液，采用水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，冷凍干燥后分別得到化合物1（25.0 mg，純度＞98.0%）、化合物2（8.6 mg，純度≈85.7%）、化合物3（16.9 mg，純度≈95.9%）、化合物4（15.1 mg，純度＞98.0%）、化合物5（13.4 mg，純度＞98.0%）和化合物6（9.16 mg，純度＞98.0%）。這些目標(biāo)組分的質(zhì)量和純度滿足下一步結(jié)構(gòu)鑒定的要求。

2.3 銀杏花粉清除DPPH自由基黃酮組分的結(jié)構(gòu)鑒定

利用紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜等技術(shù)，鑒定得到了化合物1～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下：化合物1的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)（λmax）在265、340 nm，由電噴霧電離質(zhì)譜（Electrospray Ionization Mass Spectrometry，ESI-MS）測(cè)定質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio，m/z）為609.1425 [M-H]-、611.1615 [M+H]+，推測(cè)分子式為C27H30O16，核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）顯示其黃酮醇信號(hào)及2個(gè)β-D-葡萄糖信號(hào)，與6.23(1H, d, J = 1.8 Hz, H-6)，6.47 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8)為 A環(huán)間位偶合信號(hào)，8.13 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2’, 6’)、7.16(2H, d, J = 9.0 Hz, H-3’, 5’)顯示B環(huán)對(duì)位取代，與化合物3比較，B環(huán)數(shù)據(jù)受苷化影響，推測(cè)4’位成苷。其紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振數(shù)據(jù)與 Cui等[19]的報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷?；衔?的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)（λmax）在264、314 nm，由 ESI-MS (m/z) 593.1461 [M-H]-、595.1658[M+H]+，推測(cè)分子式為 C27H30O15，NMR顯示其黃酮醇信號(hào)、1個(gè)β-D-葡萄糖信號(hào)及1個(gè)α-L-鼠李糖信號(hào)，其紫外可見(jiàn)光譜、質(zhì)譜、核磁共振數(shù)據(jù)與Kang[20]基本一致，故鑒定化合物 2為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷。化合物 3的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)（λmax）在 265、349 nm，由 ESI-MS (m/z) 447.0879 [M-H]-、449.1077 [M+H]+，推測(cè)分子式為C21H20O11，NMR顯示其黃酮醇信號(hào)及1個(gè)β-D-葡萄糖信號(hào)，6.21 (1H, d, J =1.8 Hz,H-6)、6.44 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8)為A環(huán)間位偶合信號(hào)，8.04 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2’, 6’)、6.89 (2H, d, J = 9.0 Hz,H-3’, 5’)顯示為B環(huán)對(duì)位取代，以上數(shù)據(jù)與Kishore[21]基本一致，故鑒定化合物 3為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。化合物4的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)（λmax）在264、341 nm，ESI-MS (m/z) 431.0926 [M-H]-、433.1141[M+H]+，推測(cè)分子式為 C21H20O10，NMR顯示其黃酮醇信號(hào)及1個(gè)α-L-鼠李糖信號(hào)。1H NMR顯示A環(huán)間位偶合信號(hào)，B環(huán)對(duì)位取代信號(hào)，由13C NMR苷元苷化位移符合3位成苷特征，通過(guò)與Hegazi[22]的報(bào)道對(duì)比發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物4為山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。化合物5的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)（λmax）在213、289 nm，ESI-MS (m/z) 271.0673 [M-H]-、273.0754[M+H]+，推測(cè)分子式為C15H12O5，NMR譜中5.44 (1H, dd,J = 13.2, 3.0 Hz, H-2)、3.28 (1H, dd, J = 17.1, 13.2 Hz,H-3a)、2.68 (1H, dd, J = 17.1, 3.0 Hz, H-3b)及 78.6 (C-2)、42.4 (C-3)顯示其為二氫黃酮類化合物，通過(guò)與陳胡蘭等[23-24]的報(bào)道比對(duì)，鑒定化合物5為柚皮素。化合物6的紫外可見(jiàn)光譜顯示最大吸收波長(zhǎng)（λmax）在266、368 nm，ESI-MS (m/z) 285.0340 [M-H]-、287.055 2 [M+H]+，推測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為286.0，分子式為C15H10O6，與山奈酚的分子量一致[25]，由于王國(guó)霞等[8]的研究顯示銀杏花粉的主要黃酮苷元為山奈酚，故化合物 6為山奈酚的可能性較大。將化合物 6與山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，其高效液相色譜的出峰保留時(shí)間一致，故鑒定化合物 6為山奈酚?；衔?～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

圖4 化合物1～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structures of compounds 1 to 6

將純化得到的 6種化合物重新混合制成標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，通過(guò)與圖1a以及圖2的出峰時(shí)間相比較，發(fā)現(xiàn)這 6種化合物與銀杏花粉粗提物的6種主成分以及乙酸乙酯相的6種主要清除DPPH自由基活性物質(zhì)的出峰保留時(shí)間一致。可見(jiàn)這 6種化合物即為銀杏花粉的主要清除DPPH自由基黃酮組分。

圖5 化合物1～6的混合標(biāo)準(zhǔn)品Fig.5 Mixed standards of compounds 1 to 6

2.4 純化黃酮單體的DPPH清除能力

以維生素C和蘆丁為對(duì)照，測(cè)定化合物1、2、3、4、5、6的DPPH清除率并計(jì)算IC50值。維生素C和蘆丁的IC50值分別為0.013和0.014 mg/mL，山奈酚（6）的IC50值為0.017 mg/mL，與維生素C和蘆丁相比均沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷（2）、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（3）、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4）和山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷（1）均為以山奈酚為母核的黃酮苷，其 IC50值均高于山奈酚，分別為0.210、1.530、1.730和2.250 mg/mL。柚皮素（5）的IC50值最高，超過(guò)2.500 mg/mL?？梢?jiàn)，上述化合物清除DPPH自由基的活性由高到低依次為：化合物6＞化合物 2＞化合物3＞化合物 4＞化合物 1＞化合物 5。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山奈酚廣泛存在于植物花粉及蜂花粉中[26-27]，多數(shù)以結(jié)合態(tài)的形式存在[28]，具有較好的清除自由基和防止脂質(zhì)過(guò)氧化等抗氧化作用[29-30]，與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

1）銀杏花粉粗提物具有清除DPPH自由基活性，對(duì)DPPH的半抑制率為1.32 mg/mL，乙酸乙酯相和正丁醇相對(duì)DPPH的半抑制率為0.46和0.84 mg/mL，分別是粗提物的34.85%和63.64%，乙酸乙酯相的清除DPPH活性最高。

2）乙酸乙酯相富集了6種主要銀杏花粉黃酮，而且均具有清除DPPH活性。

3）采用制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為：山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷（1）、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷（2）、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（3）、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4）、柚皮素（5）和山奈酚（6），其中山奈酚-3,4’-雙-O-β-D-葡萄糖苷（1）和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷（2）是首次從銀杏中純化得到。

4）純化產(chǎn)物清除DPPH自由基的活性由高到低依次為：化合物 6＞化合物 2＞化合物 3＞化合物 4＞化合物1＞化合物5。其中山奈酚（6）清除DPPH的IC50值為0.017 mg/mL，與維生素C及蘆丁相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

[1] 任浩，宿樹(shù)蘭，管漢亮，等. 銀杏花粉中核苷、氨基酸及無(wú)機(jī)元素的成分分析[J]. 中草藥，2014，45(19)：2839－2843.Ren Hao, Su Shulan, Guan Hanliang, et al. Component analysis of nucleosides, amino acids, and mineral elements in pollen of Gingko biloba[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2014, 45(19): 2839－2843. (in Chinese with English abstract)

[2] 王國(guó)霞，曹福亮. 4個(gè)銀杏主要產(chǎn)區(qū)的銀杏花粉營(yíng)養(yǎng)成分比較研究[J]. 浙江林業(yè)科技，2007，27(3)：8－11.Wang Guoxia, Cao Fuliang. Comparative study on nutrient components of Ginkgo biloba pollen from 4 major production areas[J]. Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology, 2007, 27(3): 8－11. (in Chinese with English abstract)

[3] 郝功元，吳彩娥，楊劍婷，等. 銀杏花粉粗多糖脫色工藝研究[J].食品科學(xué)，2009，30(14)：136－139.Hao Gongyuan, Wu Cai’e, Yang Jianting, et al.Decolorization of crude polysaccharide from Ginkgo biloba pollen[J]. Food Science, 2009, 30(14): 136－139. (in Chinese with English abstract)

[4] 裘紀(jì)瑩，陳相艷，劉孝永，等. 銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量及總黃酮測(cè)定方法比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(10)：371－373.Qiu Jiying, Chen Xiangyan, Liu Xiaoyong, et al. Total flavonoids contents in Ginkgo pollen and its fermentation beverage and comparative study on their determination methods[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2015, 43(10): 371－373. (in Chinese with English abstract)

[5] 王未名，裘紀(jì)瑩，劉孝永，等. 銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對(duì)小鼠的急性毒性評(píng)價(jià)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(5)：77－78，213.Wang Weiming, Qiu Jiying, Liu Xiaoyong, et al. Acute toxic effects of Ginkgo pollen and its fermentation beverage on mice[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2017, 45(5):77－78, 213. (in Chinese with English abstract)

[6] Xiao J, Wang T, Li P, et al. Development of two step liquid-liquid extraction tandem UHPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of Ginkgo flavonoids, terpene lactones and nimodipine in rat plasma: Application to the pharmacokinetic study of the combination of Ginkgo biloba dispersible tablets and Nimodipine tablets[J]. Journal of Chromatography B, 2016, 1028: 33－41.

[7] Wang Y, Liu Y, Wu Q, et al. Rapid and sensitive determination of major active ingredients and toxic components in Ginkgo biloba leaves extract (EGb 761) by a validated UPLC–MS-MS method[J]. Journal of Chromatographic Science, 2017, 55(4): 459－464.

[8] 王國(guó)霞，曹福亮，汪貴斌，等. 不同地區(qū)銀杏花粉黃酮和內(nèi)酯含量的差異性[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，31(3)：34－38.Wang Guoxia, Cao Fuliang, Wang Guibin, et al. Comparative study on the contents of flavonoids and lactones in Ginkgo pollen from different regions[J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition), 2007, 31(3): 34－38.(in Chinese with English abstract)

[9] 董宏博，崔桂花，趙文秀. 循環(huán)伏安法測(cè)定銀杏葉中蘆丁的含量[J]. 中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22(32)：12－14.Dong Hongbo, Cui Guihua, Zhao Wenxiu. Determination of rutin content in Ginkgo leaves by cyclic voltammetry[J].China Modern Medicine, 2015, 22(32): 12－14. (in Chinese with English abstract)

[10] 徐澄梅，任浩，錢(qián)大瑋，等. 采用UPLC－TQ－MS同時(shí)測(cè)定銀杏花粉 24種資源性化學(xué)成分[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40(11)：2157－2162.Xu Chengmei, Ren Hao, Qian Dawei, et al. Determine resource chemical component in Ginkgo pollen simultaneously by UPLC-TQ-MS[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(11): 2157－2162. (in Chinese with English abstract)

[11] Wang G, Huang X, Pei D, et al. DPPH-HPLC-DAD analysis combined HSCCC for screening and identification of radical scavengers in Cynomoriumsongaricum rupr[J]. New Journal of Chemistry, 2016, 40: 3885－3891.

[12] Li A, Xuan H, Sun A, et al. Preparative separation of polyphenols from water-soluble fraction of Chinese propolis using macroporous absorptive resin coupled with preparative high performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography. B, 2016, 1012－1013: 42－49.

[13] 裘紀(jì)瑩，龐停停，周慶新，等. 銀杏花粉抗氧化成分的提取工藝優(yōu)化[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，30(7)：1365－1372.Qiu Jiying, Pang Tingting, Zhou Qingxin, et al. Optimization of extraction technology of antioxidant components from Ginkgo pollen[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2016, 30(7): 1365－1372. (in Chinese with English abstract)

[14] Yang L, Sun G, Guo Y, et al. Holistic evaluation of quality consistency of Ixeris sonchifolia (Bunge) hance injectables by quantitative fingerprinting in combination with antioxidant activity and chemometric methods[J]. Plos One,2016, 11(2): 1－19.

[15] Qiu J, Chen L, Zhu Q, et al. Screening natural antioxidants in peanut shell using DPPH-HPLC-DAD-TOF/ MS methods[J].Food Chemistry, 2012, 135(4): 2366－2371.

[16] Xiong S L, Chen S S, Li L J, et al. Purity analysis method of dihydroxylammonium 5,5?-bistetrazole-1,1?-diolate (TKX-50)[J]. Journal of Energetic Materials, 2016, 34(3): 279－287.

[17] Schweiggert R M, Vargas E, Conrad J, et al. Carotenoids,carotenoid esters, and anthocyanins of yellow-, orange-, and red-peeled cashew apples (Anacardium occidentale L.)[J].Food Chemistry, 2016, 200: 274－282.

[18] Forino M, Tartaglione L, Dell'Aversano C, et al. NMR-based identification of the phenolic profile of fruits of Lycium barbarum (goji berries). Isolation and structural determination of a novel N-feruloyl tyramine dimer as the most abundant antioxidant polyphenol of goji berries[J].Food Chemistry, 2016, 194: 1254－1259.

[19] Cui B, Nakamura M, Kinjo J, et al. Chemical constituents of Astragali semen[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin,1993, 41(1): 178－182.

[20] Kang W, Wang J, Ji Z. Flavonoids in Luculia pinceana[J].Chemistry of Natural Compounds, 2008, 44(5): 644－645.

[21] Kishore P H, Reddy M V B, Gunasekar D, et al. A new coumestan from Tephrosia calophylla[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51(2): 194－196.

[22] Hegazi N, Hashim A. Grandisin, 2-methoxy 6, 7, 2',6'-tetrahydroxy flavanone 6-O-glucoside, from Cassia grandis leaves-antioxidant and cytotoxic activities[J]. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016, 71(9): 544－547.

[23] 陳胡蘭，董小萍，張梅，等. 紫花地丁化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2010，41(6)：874－877.

[24] Pan Y G, Li Y X, Yuan M Q. Isolation, purification and identification of etiolation substrate from fresh-cut Chinese water-chestnut (Eleocharis tuberosa)[J]. Food Chemistry,2015, 186: 119－122.

[25] Rajauria G, Foley B, Abu-Ghannam N. Identification and characterization of phenolic antioxidant compounds from brown Irish seaweed Himanthalia elongata using LC-DAD–ESI-MS/MS[J]. Innovative Food Science &Emerging Technologies, 2016, 37: 261－268.

[26] Ares A M, Valverde S, Bernal J L, et al. Extraction and determination of bioactive compounds from bee pollen[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2018,147: 110－124.

[27] Akbari M, Nejadsatari T, Noori M, et al. Pollen grain flavonoid studies of four Iranian Trifolium (Leguminosae)taxa as future honey biomarkers[J]. Phytologia Balcanica:International Journal of Balkan Flora and Vegetation, 2017,23(1): 17－22.

[28] Tu X, Ma S, Gao Z, et al. One-step extraction and hydrolysis of flavonoid glycosides in rape bee pollen based on soxhlet-assisted matrix solid phase dispersion[J].Phytochemical Analysis, 2017, 28(6): 505－511.

[29] de Florio Almeida J, dos Reis A S, Heldt L F S, et al.Lyophilized bee pollen extract: A natural antioxidant source to prevent lipid oxidation in refrigerated sausages[J].LWT-Food Science and Technology, 2017, 76: 299－305.

[30] Dar R A, Brahman P K, Khurana N, et al. Evaluation of antioxidant activity of crocin, podophyllotoxin and kaempferol by chemical, biochemical and electrochemical assays[J].Arabian Journal of Chemistry, 2017, 10: 1119－1128.